[發明專利]一種抗草甘膦油菜的培育方法

有效

• 申請號: 201810522008.2
• 申請日: 2018-06-21
• 公開（公告）號: CN110699374B
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 周永明;李杰華;黃會斌;林擁軍;劉子鐸;范楚川;張椿雨
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/11;C12Q1/6895;A01H5/00;A01H6/20;A01H4/00
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 楊采良

1.一種抗草甘膦油菜的培育方法，其特征包括下列步驟：

A、以pCAMBIA1300質粒為起始質粒，構建包含如SEQ ID NO:1所示序列的目標基因I.variabilis-EPSPS*的表達載體pTGH-1；將甘藍型低芥酸油菜甲A177種子消毒后接種在播種培養基上進行暗培養；然后將含有目標基因的表達載體pTGH-1的農桿菌工程菌與甘藍型油菜下胚軸用侵染液侵染后在共培養培養基上進行共掊養，在含有草甘膦的愈傷組織培養基上篩選得到抗性愈傷組織；將抗性愈傷組織轉移至分化培養基上誘導分化；當分化的外植體上再生出完整的芽時，切掉原生根，并置于生根培養基上進行生根培養；當新生根長到3cm時，轉移至溫室，將壯苗后的再生苗移植到大田栽種，即為T0代轉基因植株；

B、在T0代植株生長期間，用CTAB法提取T0代植株葉片基因組DNA，通過Southern雜交鑒定基因的拷貝數；將單拷貝的植株種成株系；通過田間抗性調查和PCR檢測，種子成熟后，收獲T0代植株上的種子，即為T1代種子；

C、在收獲T1代種子的第二年，挑選轉基因純合株系進行室內和田間抗草甘膦試驗，調查其農藝性狀；

D、采用反向PCR和Tail-PCR方法，對抗草甘膦抗性有差別的單株作側翼序列分析，獲得高抗除草劑草甘膦的轉基因油菜株系；步驟D中所述的側翼序列分析的方法包括采用一種復合轉基因結構，該復合轉基因結構由以下幾個序列沿5’到3’方向順序連接而成：(i)SEQID NO：3所示的插入位點5’端側翼序列；(ii)SEQ ID NO：1所示的插入的外源基因序列；以及(iii)SEQ ID NO：5所示的插入位點3’端側翼序列；所述側翼序列分析的定性PCR反應中的引物組合序列如下所述：SP2：CAGGTGGAGAACGTCGGTACGACT，P1：CTCTAGCCAATACGCAAACCGCC；反向PCR反應中第二輪擴增的引物組合序列如下所述：SP3：GGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCA，P3：GTTGTGTGGAATTGTGAGCGGA；特異性驗證PCR反應中的引物組合序列如下所述：

P5：ATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGG，EPSPS-X6R：CTCGAAGCTATCGAAACTCCG

其中：上述步驟中所用的培養基成分及其配制如下所述：

1)播種培養基：

以配制500mL培養基計:1/2MS 1.1g，蔗糖15g，用蒸餾水定容至500mL，pH5.84-5.88，加瓊脂粉3.5g；

2)共培養培養基：

以配制500mL培養基計:MS2.2g，蔗糖15g，甘露醇l9g，2,4-D 500μL，激動素500μL，用蒸餾水定容至500mL，pH5.84-5.88，加瓊脂粉3.5g；使用時快冷時加入500u的乙酰丁香酮；

3)侵染液：

以配制100mL培養基計：MS 0.44g，蔗糖3g，用蒸餾水定容至500mL，pH5.84-5.88，滅菌后使用時加入100μL的乙酰丁香酮；

4)愈傷組織誘導培養基：

以配制500mL培養基計:MS 2.2g，蔗糖15g，甘露醇l 9g，2,4-D 500μL，激動素500μL，用蒸餾水定容至500mL，調pH值5.84-5.88，加瓊脂粉3.5g；滅菌后使用時加STS 75μL，特美汀500μL，草甘膦400μL；

5)分化培養基

以配制500mL培養基計:MS 2.2g，葡萄糖5g，木糖0.125g，2-(N-嗎啉)乙磺酸0.3g，用蒸餾水定容至500mL，pH5.84-5.88，加瓊脂3.5g；滅菌后使用時加入：激動素500μL，吲哚乙酸100μL，特美汀500μL，AgNO₃75μL，草甘膦400μL；

6)生根培養基

以配制500mL培養基計:1/2MS 1.1g，蔗糖15g，用蒸餾水定容至500mL，p5.84-5.88，加瓊脂粉3.5g，滅菌使用時加入特美汀500μL。