[發明專利]一種微小隱孢子蟲檢測用TSP7多肽序列及其應用

有效

• 申請號: 201810519141.2
• 申請日: 2018-05-25
• 公開（公告）號: CN108752423B
• 公開（公告）日: 2019-12-17
• 發明（設計）人: 尹繼剛;王東強;張天宇;焦新;邵青延
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 22202 長春市東師專利事務所
• 代理人: 張鐵生

本發明提供了一種微小隱孢子蟲檢測用TSP7多肽序列及其應用，它是利用微小隱孢子蟲多肽TSP7與KLH偶聯后作為抗原，免疫Balb/c小鼠，制備單克隆抗體，收集樣品（卵囊），脫囊液脫囊，室溫孵育成子孢子，透化液透化，分別加入單克隆抗體、二抗、PBS緩沖液、熒光染料、抗熒光猝滅劑，利用熒光顯微鏡觀察樣本。經反復多次實驗表明，偶聯KLH的六種隱孢子蟲特異性多肽具有良好的免疫源性，免疫小鼠可以均可得到理想效價的雜交瘤細胞；每次篩選的都能篩選出效價均達到1:16000以上的單克隆抗體，都可用作熒光檢測。利用TSP7合成多肽做制備的單克隆抗體可以很靈敏的標記在微小隱孢子蟲子孢子的表面，沒有發生交叉反應。

技術領域

本發明屬生物學檢測技術領域，具體涉及一種微小隱孢子蟲檢測用TSP7多肽序列及其應用。

背景技術

微小隱孢子蟲是導致全球范圍內人和其他哺乳動物隱孢子蟲病的一個主要病原。微小隱孢子蟲主要通過糞-口途徑攝取被隱孢子蟲污染的水或事物進行傳播。其主要寄生于胃腸道上皮細胞的微絨毛邊緣，感染宿主后癥狀表現輕重不一。在免疫功能正常的人群中，通過在腸上皮細胞中增殖導致的腹瀉一般為自限性，但這是免疫力低下者主要的致死原因。微小隱孢子蟲卵囊可以在環境中長期存活，并可以抵抗常規的次氯酸鈉消毒，這成為控制飲用水中微小隱孢子蟲污染的一大難題。迄今為止尚無針對隱孢子蟲的特效藥物和高效防治微小隱孢子蟲的疫苗，這進一步加大了微小隱孢子蟲的防治工作。目前，微小隱孢子蟲的檢測方法主要包括病原學檢測、免疫學檢測以及分子生物學檢測方法。但這些方法大都費時費力，對檢測儀器要求較高且靈敏度不足。因此尋找新的檢測方法至關重要。

但是目前國內外的微小隱孢子蟲的臨床檢測方法主要靠抗酸染色等方法進行檢測。抗酸染色針對的是隱孢子蟲的卵囊壁，其特異性低，敏感性差，并且還可以檢測出沒有感染能力的死蟲，無法判斷被檢測的樣本是否具有感染能力。因此，尋找新的敏感、特異的檢測方法對微小隱孢子蟲流行病調查和防治研究具有重要意義。本文通過設計合成微小隱孢子蟲多種蛋白質的多肽，免疫小鼠制備單克隆抗體，通過對比不同抗體的檢測效果，選擇最優抗體作為微小隱孢子蟲檢測用抗體，用于微小隱孢子蟲的臨床檢查。

發明內容

本發明目的是為解決現有檢測微小隱孢子蟲方法特異性低、敏感性差的問題，而提供一種微小隱孢子蟲檢測方法。

微小隱孢子蟲多肽TSP7，其氨基酸序列如序列表 SEQ ID No.1所示；

微小隱孢子蟲卵囊間接免疫熒光檢測試劑盒，它包括：微小隱孢子蟲多肽TSP7與KLH偶聯后作為抗原制備的單克隆抗體；

所述的微小隱孢子蟲卵囊間接免疫熒光檢測試劑盒，它還包括二抗、PBS緩沖液、熒光染料、抗熒光猝滅劑；

所述的熒光染料為4',6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI；

所述的微小隱孢子蟲卵囊間接免疫熒光檢測試劑盒，還包括脫囊液、多聚甲醛、透化液；

所述的脫囊液為0.75%牛膽酸鈉鹽和0.25%胰酶；

所述的透化液為甲醛：丙酮體積比為1：1。

微小隱孢子蟲卵囊間接免疫熒光檢測試劑盒在檢測微小隱孢子蟲子孢子方面的應用。

一種微小隱孢子蟲檢測方法，包括以下步驟：

1）將樣本加入次氯酸鈉，除去大部分細菌及雜質，收集濃縮物；

2）將收集到的濃縮物加入脫囊液，于36~38℃作用0.5~1.5h；

3）4500~5500g離心8~12分鐘除去脫囊液；

4）將離心后的混合物加入多聚甲醛，室溫作用25~35min；

5）4500~5500g離心8~12分鐘除去多聚甲醛；