[發(fā)明專利]基于血管基膜結(jié)構(gòu)在心血管植入材料表面仿生構(gòu)建多功能修飾層的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810506075.5
• 申請日: 2018-05-24
• 公開（公告）號: CN108619566B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李敬安;張琨;關(guān)紹康;韓叢珍;朱世杰;王利國;王俊;常蕾
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號: A61L27/34
• 分類號: A61L27/34;A61L27/28;A61L27/06;A61L27/04;A61L27/50
• 代理公司: 鄭州銀河專利代理有限公司 41158
• 代理人: 陳玄

1.一種基于血管基膜結(jié)構(gòu)在心血管植入材料表面仿生構(gòu)建多功能修飾層的方法，其特征在于它包括以下步驟：

A、在材料表面制備分子量為4×10³-1×10⁷ DA的透明質(zhì)酸條紋狀微圖形，透明質(zhì)酸為HA；透明質(zhì)酸條紋狀微圖形中HA的寬度為100nm-100μm，裸露材料條紋寬度為100nm-100μm，待用；

B、材料表面圖案化血管平滑肌細胞外基質(zhì)的制備：將傳代2-5代的血管平滑肌細胞以1×10³-1×10⁶個/ml的密度種植于步驟A所述透明質(zhì)酸條紋狀微圖形表面，在37℃，體積百分比濃度5% CO₂的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1-15天，該步驟得到經(jīng)HA微圖形調(diào)控后，形狀拉長、排布有序的收縮型平滑肌細胞；吸除用過的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)細胞的樣品用37℃的PBS清洗1-5遍后，加入脫細胞液，在37℃，體積百分比濃度5% CO₂的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下脫細胞處理10-120分鐘，取出后吸除脫細胞液，用37℃的PBS再次清洗1-5遍，37℃干燥后即得圖案化血管平滑肌細胞外基質(zhì)；

C、材料表面雙層圖案化血管平滑肌/內(nèi)皮細胞外基質(zhì)的制備：將傳代2-5代的血管內(nèi)皮細胞以1×10³-1×10⁶個/ml的密度種植于步驟B所述圖案化血管平滑肌細胞外基質(zhì)表面，在37℃，體積百分比濃度5% CO₂的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1-15天，該步驟得到經(jīng)HA微圖形調(diào)控后，形狀拉長、排布有序的血管內(nèi)皮細胞；吸除用過的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)細胞的樣品用37℃的PBS清洗1-5遍后，加入脫細胞液，在37℃，體積百分比濃度5% CO₂的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下脫細胞處理10-120分鐘，取出后吸除脫細胞液，用37℃的PBS再次清洗1-5遍，37℃干燥后即得目標(biāo)物，步驟A、步驟B和步驟C均在無菌條件下完成；

所述材料表面透明質(zhì)酸條紋狀微圖形具有在體外條件下模仿體內(nèi)血流剪力調(diào)控平滑肌細胞與內(nèi)皮細胞生理表型的作用，在此基礎(chǔ)上采用雙細胞培養(yǎng)-脫附模式所獲得的仿生細胞外基質(zhì)修飾層具有良好的血液相容性和細胞相容性； A步驟中所述透明質(zhì)酸分子量為4×10³-1×10⁷ DA，所述材料表面微圖形為透明質(zhì)酸條紋狀微圖形，透明質(zhì)酸條紋狀微圖形中HA的寬度為100nm-100μm，裸露材料條紋寬度為100nm-100μm； B步驟中所述血管平滑肌細胞為傳代2-5代的平滑肌細胞，種植密度為1×10³-1×10⁶個/ml，在37℃，體積百分比濃度5% CO₂的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1-15天應(yīng)得到形態(tài)拉長排布有序的收縮型平滑肌細胞；所述脫細胞條件為脫細胞前后用37℃的PBS次清洗樣品表面1-5遍，加入脫細胞液后在37℃，體積百分比濃度5% CO₂的標(biāo)準(zhǔn)條件下孵化10-120分鐘；C步驟中所述血管內(nèi)皮細胞為傳代2-5代的內(nèi)皮細胞，種植密度為1×10³-1×10⁶個/ml，在37℃，體積百分比濃度5% CO₂的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1-15天應(yīng)得到形態(tài)拉長排布有序的內(nèi)皮細胞；所述脫細胞條件為脫細胞前后用37℃的PBS次清洗樣品表面1-5遍，加入脫細胞液后在37℃，體積百分比濃度5% CO₂的標(biāo)準(zhǔn)條件下孵化10-120分鐘；

步驟B和步驟C所述脫細胞液配置方法為：用0.1-1%的Triton X–100 溶液與1-27%的氨水混合，混合體積配比為Triton X–100：氨水 =（80-120）ml ：（60-180）μl ；配液完畢后需用濾膜過濾除菌，4℃避光保存。