[發明專利]一種重組人肌紅蛋白的表達純化方法在審
| 申請號： | 201810502489.0 | 申請日： | 2018-05-23 |
| 公開（公告）號： | CN108410899A | 公開（公告）日： | 2018-08-17 |
| 發明（設計）人： | 許德晨;景宏維;黃力;楊紅 | 申請（專利權）人： | 基蛋生物科技股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/70 | 分類號： | C12N15/70;C12N15/12;C07K14/805 |
| 代理公司： | 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371 | 代理人： | 李佳 |
| 地址： | 210000 江蘇省南京*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 人肌紅蛋白 轉化子 人肌紅蛋白基因 大腸桿菌表達 臨床醫學檢測 柱親和層析 大腸桿菌 表達質粒 高穩定性 擴大培養 濾膜過濾 融合標簽 體外診斷 細胞破碎 誘導表達 質粒轉化 高產率 高活性 洗脫 制備 診斷 表現 | ||
1.一種重組人肌紅蛋白的表達純化方法，其特征在于，包括：
將重組人肌紅蛋白基因序列連入大腸桿菌表達載體，獲得人肌紅蛋白表達質粒，將所述質粒轉化到大腸桿菌得到轉化子；
對所述轉化子擴大培養誘導表達后將細胞破碎、離心后收集上清；表達出的重組人肌紅蛋白N端含有Trx-(His)6融合標簽；將所述上清經濾膜過濾后用Ni-柱親和層析，洗脫后即得重組人肌紅蛋白。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組人肌紅蛋白基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌表達載體為pET-32a(+)。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌為BL21(DE3)。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉化條件包括：
將所述人肌紅蛋白表達質粒冰浴條件下加入到處于感受態的所述大腸桿菌中，冰浴放置15min～25min，熱激80s～100s，36℃～38℃、200rpm～240rpm震蕩培養40min～60min后涂板篩選轉化子。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述誘導為用終濃度0.05mM～0.8mM異丙基硫代半乳糖苷進行誘導表達；
優選的，所述誘導為用終濃度0.10mM異丙基硫代半乳糖苷進行誘導表達。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，加入所述異丙基硫代半乳糖苷時，菌液培養至OD600＝0.6～0.8。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，在加入所述異丙基硫代半乳糖苷后，還包括：16℃～38℃、200rpm～240rpm震蕩培養3h～20h；
優選的，在加入所述異丙基硫代半乳糖苷后，還包括：37℃、200rpm～240rpm震蕩培養3h～5h。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞破碎在緩沖液中進行，所述緩沖液包括15mM～25mM咪唑；
優選的，所述緩沖液的成分包括：
pH 8.2～8.8的40mM～60mM Tris-HCl，0.4M～0.6M NaCl，15mM～25mM咪唑。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脫所用的洗脫液包括90mM～500mM咪唑；
優選的，所述洗脫液的成分包括：
pH 8.2～8.8的40mM～60mM Tris-HCl，0.4M～0.6M NaCl，90mM～500mM咪唑。
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