[發(fā)明專利]一種檢測短串聯(lián)重復(fù)序列擴(kuò)張的方法

有效

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• 申請日: 2018-05-23
• 公開（公告）號: CN108660200B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊旗;唐北沙;梁帆;江泓;楊帆;沈璐;汪德鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 北京希望組生物科技有限公司;中南大學(xué)湘雅醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;王永偉

本發(fā)明提供了一種檢測短串聯(lián)重復(fù)序列擴(kuò)張的方法，其包括如下步驟：1)序列比對；2)RepeatHMM檢測三代測序數(shù)據(jù)短串聯(lián)重復(fù)；3)inScan檢測短串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的序列插入；4)計算RepeatHMM檢測結(jié)果與短串聯(lián)重復(fù)區(qū)域的序列插入檢測結(jié)果的交集。本發(fā)明結(jié)合序列插入檢測和RepeatHMM短串聯(lián)重復(fù)檢測結(jié)果，提高了檢測短串聯(lián)重復(fù)序列擴(kuò)張的特異性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因測序技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及短串聯(lián)重復(fù)序列(STR，short tandemrepeat)擴(kuò)張檢測方法。

背景技術(shù)

短串聯(lián)重復(fù)指DNA序列中的多個核苷酸(重復(fù)單元數(shù)目大于或等于2小于或等于6)前后首尾相連而構(gòu)成的重復(fù)序列，重復(fù)單元數(shù)目的變化會對基因組結(jié)構(gòu)造成重要影響，進(jìn)而可能會影響基因的表達(dá)、修飾和相應(yīng)的生理功能；短串聯(lián)重復(fù)單元數(shù)目增多時稱為短串聯(lián)重復(fù)擴(kuò)張。

三代測序指的是單條DNA/RNA分子測序技術(shù)，目前商用的三代測序技術(shù)有Pacbio公司的單分子實(shí)時測序技術(shù)和Nanopore公司的納米孔測序技術(shù)。Pacbio公司的單分子實(shí)時測序技術(shù)測得的reads平均長度為10Kb，部分可以達(dá)到100kbp，Nanopore公司的納米孔測序技術(shù)測得的reads平均長度也為10Kb，部分可以達(dá)到2.3Mbp。三代測序與二代測序相比的優(yōu)勢是讀長更長、無GC偏好性，缺點(diǎn)是序列的錯誤率較高(約15％的錯誤率)。三代測序產(chǎn)生的長reads可以跨越短串聯(lián)重復(fù)，從而準(zhǔn)確檢測重復(fù)單元的數(shù)目，同時可以檢測二代測序無法檢測的大尺度的短串聯(lián)重復(fù)擴(kuò)張(擴(kuò)張長度大于二代測序的讀長(100-300bp))。

現(xiàn)有用于三代測序檢測短串聯(lián)重復(fù)的方法是RepeatHMM(Liu,Q.,Zhang,P.,Wang,D.,Gu,W.Wang,K.Interrogating the“unsequenceable”genomic trinucleotide repeatdisorders by long-read sequencing.Genome Medicine,65(2017))，該方法主要應(yīng)用隱馬爾可夫模型進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)單元的識別。但是RepeatHMM在檢測短串聯(lián)重復(fù)擴(kuò)張時存在較高的假陽性。該技術(shù)方案的主要步驟如下：

1)選擇感興趣的短串聯(lián)重復(fù)：從參考基因組序列中選擇感興趣的短串聯(lián)重復(fù)，記錄該短串聯(lián)重復(fù)在參考基因組上的位置(染色體編號、起始位置、終止位置)、重復(fù)單元(如：CGG)和重復(fù)單元數(shù)目；

2)將三代測序的長reads比對到參考基因組：首先使用TRF軟件(tandem repeatfinder)檢測長reads上是否存在步驟1)中預(yù)設(shè)的串聯(lián)重復(fù)，如果存在就將長reads切割為多段側(cè)翼區(qū)序列和重復(fù)區(qū)序列；然后使用bwa mem和特定參數(shù)將側(cè)翼區(qū)的片段比對到參考基因組，如果這些有序的側(cè)翼區(qū)序列都成功比對，那么利用這些比對信息確定長reads上重復(fù)區(qū)域的起始位置和終止位置。這種方式被定義為“切分-重比對”策略；對于“切分-重比對”策略不能識別的長reads，使用bwa mem直接將其比對到參考基因組，如果長reads不能比對到參考基因組則丟棄；

3)確定reads上的重復(fù)區(qū)域：利用包含重復(fù)區(qū)的長reads的上游和下游序列(默認(rèn)為18bp，用戶可自定義)信息；分別使用bwa mem將上游和下游序列比對到參考基因組，如果它們都有高的比對一致性，那么在重復(fù)區(qū)和上下游序列之間加上一定數(shù)目的N，用來確保下面的過程不會將上下游序列識別為重復(fù)區(qū)序列；

4)長reads錯誤校正：首先構(gòu)造一段比參考基因組上短串聯(lián)重復(fù)長50％的完美短串聯(lián)重復(fù)(重復(fù)單元完全一致的短串聯(lián)重復(fù))序列，例如，參考基因組上短串聯(lián)重復(fù)的重復(fù)單元為CTG，長度為30個單元，新構(gòu)造的完美短串聯(lián)重復(fù)的重復(fù)單元也為CTG，長度為45個單元。然后使用一種非對稱的比對算法UnsymSeqAlg，將長reads比對到新構(gòu)造的完美短串聯(lián)重復(fù)序列，根據(jù)比對結(jié)果進(jìn)行序列校正；

5)檢測重復(fù)單元數(shù)目：區(qū)域內(nèi)的每一條長reads都通過隱馬爾可夫模型識別重復(fù)單元數(shù)目；