[發明專利]一種尿液外泌體hsa-microRNA206及其應用

在審

• 申請號: 201810494762.X
• 申請日: 2018-05-22
• 公開（公告）號: CN108841947A
• 公開（公告）日: 2018-11-20
• 發明（設計）人: 陳鵬;陳德龍;何偉;王海彬;姜山;鄒許亭
• 申請（專利權）人: 廣州中醫藥大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12N15/113
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 崔紅麗

本發明公開一種尿液外泌體hsa?microRNA206及其應用，屬于醫藥技術領域。本發明是基于外泌體液體活檢技術，利用Illumina Hiseq2500測序平臺的下一代測序技術，用于發現尿液外泌體中激素性股骨頭壞死中差異表達的microRNA(s)；qRT?PCR驗證差異表達的microRNA(s)，得到差異表達明顯的潛在標志物：尿液外泌體hsa?miR206，其序列如SEQ ID NO：1所示。提取尿液外泌體，利用下一代測序技術分析尿液外泌體中的hsa?miR206的變化，可以早于MRI發現激素性股骨頭壞死；價格低廉；便于攜帶及推廣。

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，涉及一種超早期診斷激素性股骨頭壞死的生物標志物尿液外泌體hsa-microRNA206，特別涉及一種尿液外泌體hsa-microRNA206及其應用。

背景技術

股骨頭壞死(ONFH)是具有高致殘率的骨科疾病，好發于30-50歲的中青年，容易造成患者勞動能力喪失，給家庭及社會帶來了沉重的負擔[1，2]。如果發現不及時，未能采取干預措施，80％的ONFH會快速進展到骨壞死的晚期(關節炎期)，最終接受全髖關節置換治療[3]。因此盡可能早的利用無創檢測手段發現股骨頭壞死，進行早期干預，延緩甚至避免關節置換是臨床工作中亟需解決的問題[4]。目前無創性的診斷方式包括普通X線平片、計算機斷層掃描(CT)、核磁共振成像(MRI)、骨掃描等。相比較于其他的無創檢測手段，MRI檢測被認為是目前診斷ONFH的“金標準”。然而MRI僅能對發生器質性(股骨頭形態)改變的股骨頭提供信息，無法在股骨頭發生功能性改變(軟骨退變、軟骨皺褶等)的階段做出診斷[5]；而且MRI價格昂貴、無法用于有金屬內植物的患者等諸多因素，限制了MRI在股骨頭壞死發生早期的臨床使用價值。

液體活檢(Liquid biopsy)是一種新型的檢測方法，通過捕獲并準確分析進入體液的其它細胞或DNA，從而對疾病做出早期診斷，目前已廣泛應用于多種癌癥的診斷[6]。該檢測方法是第一次非介入性地，可重復性地獲取待檢樣本，醫生們從而可以建立起對該疾病的基因表達譜，靶向突變用藥，快速判斷治療效果以及實時監測疾病的發展而調節治療方案[7，8]。近年來,作為液體活檢的重要組成部分，一種叫做外泌體(exosomes)的小囊泡正受到越來越廣泛的關注[9]。

外泌體通過非網格蛋白或網格蛋白介導的胞吞作用形成初級內體，酸化初級內體而得到次級內體，進而內體膜內陷形成多囊泡體。在多泡體中存在腔內小囊泡，其內有許多內容物包括核糖核酸(miRNAs，mRNAs)、蛋白(受體、酶等)，脂質，還有病毒顆粒。多囊泡體通過溶酶體降解或者通過與膜融合釋放，即釋放出外泌體(見圖1)[10]。

作為活細胞分泌來的膜性囊泡，外泌體天然存在于體液(血液、唾液、尿液等)以及細胞培養基中[11]。2007年，Valadi等發現細胞分泌的外泌體中含有生物活性的mRNAs、microRNAs(miRNAs)、脂質和蛋白質，這使得研究人員對外泌體的研究熱情激增[12]。隨著研究的進展，科學家發現外泌體不僅在細胞間通訊及局部微環境的調節中發揮著特殊作用，而且在血管內凝血、體內垃圾的管理上也起到重要作用(見圖2)[13，14]。

MiRNAs是非編碼RNA(non-coding RNAs)家族中的重要一員，大約有17-24個核苷酸長度，通過與目標mRNA上的3′非翻譯區(3′UTR)結合來調控翻譯后的基因沉默，進而抑制相關基因的表達[15]。miRNAs是外泌體中的主要小RNA，它們被周圍或者其他遠端部位的細胞“吞入”后，進而調節受體細胞的功能，影響著人體內的生物信號網絡，參與細胞增殖、細胞分化、細胞轉移、疾病的發生以及疾病的進展[16-20]。