[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)新型雞呼腸孤病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810494536.1
• 申請(qǐng)日: 2018-05-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108411041B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 刁有祥;唐熠;姜曉寧
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 濟(jì)南譽(yù)豐專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙企業(yè)) 37240
• 代理人: 李茜

本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)新型雞呼腸孤病毒的熒光定量PCR試劑盒及應(yīng)用。所述熒光定量PCR試劑盒中含有SEQ ID NO.1?SEQ ID NO.2所示的引物和SEQ ID NO.3所示的探針，以及標(biāo)準(zhǔn)品和熒光定量PCR反應(yīng)試劑。本發(fā)明的熒光定量PCR試劑盒可以對(duì)該新型雞呼腸孤病毒進(jìn)行檢測(cè)，該試劑盒的特異性強(qiáng)，只與新型雞呼腸孤病毒特異性結(jié)合，與其他雞源病毒都沒(méi)有交叉反應(yīng)；而且檢測(cè)的靈敏度高，在標(biāo)準(zhǔn)品為10¹?10⁹拷貝范圍內(nèi)都有極好的線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)范圍可達(dá)9個(gè)數(shù)量級(jí)，可以高效檢測(cè)新型雞呼腸孤病毒病雞組織以及無(wú)臨床癥狀的病毒攜帶雞，提高了檢測(cè)效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及禽病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)新型雞呼腸孤病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)

禽呼腸孤病毒(Avian orthoreovirus，ARV)屬于呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬，是引起雞病毒性關(guān)節(jié)炎的病原，主要感染肉雞，肉蛋兼用型雞也有感染。ARV主要侵害雞的跗關(guān)節(jié)、趾關(guān)節(jié)、脛跖關(guān)節(jié)及其肌腱，引起關(guān)節(jié)滑膜炎或腱鞘炎等。患病雞通常呈現(xiàn)跛行、蹲坐、不愿走動(dòng)及食欲減退甚至廢絕的癥狀，造成了飼料轉(zhuǎn)化率低、死淘殘雞增多，降低了生產(chǎn)效益，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。自20世紀(jì)80年代中期該病在我國(guó)首次報(bào)道以來(lái)我國(guó)ARV的感染情況呈現(xiàn)加重的趨勢(shì)，臨床表現(xiàn)也越來(lái)越多樣化。

2016年，我國(guó)山東、江蘇等地肉種雞場(chǎng)和商品代肉雞場(chǎng)相繼以關(guān)節(jié)腫脹和跛行為癥狀的疾病。該病傳播速度快、發(fā)病范圍廣，不同日齡、不同品種的雞都可以感染，但對(duì)商品肉雞的危害尤為嚴(yán)重。發(fā)病初期主要表現(xiàn)為體溫升高、精神沉郁、食欲廢絕及營(yíng)養(yǎng)吸收不良等，隨著病程的發(fā)展，感染雞逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、發(fā)炎，不愿走動(dòng)，跛行等癥狀；剖檢可見(jiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)纖維素性滲出，腱鞘炎，腓腸腱斷裂等病理變化，給我國(guó)肉雞養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該病的爆發(fā)是由一種新型的雞呼腸孤病毒感染所致，目前尚無(wú)疫苗可以進(jìn)行預(yù)防，現(xiàn)有市售的雞呼腸孤病毒疫苗無(wú)法對(duì)該病進(jìn)行有效的防控；常規(guī)的抗病毒和抗菌治療方法無(wú)效。在當(dāng)前這種情況下，控制該病的有效措施是對(duì)該新型雞呼腸孤病毒感染進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以便及早發(fā)現(xiàn)感染雞群對(duì)其采取隔離或撲殺措施，以減少新型雞呼腸孤病毒感染所帶來(lái)的損失。

目前，對(duì)于禽呼腸孤病毒的檢測(cè)方法主要包括細(xì)胞學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷及分子生物學(xué)診斷三大類(lèi)，其中，細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)主要是利用細(xì)胞分離培養(yǎng)和電鏡觀(guān)察。該方法操作較為繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)條件要求較高。免疫學(xué)診斷技術(shù)主要包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和免疫熒光方法，該類(lèi)方法靈敏較高，但對(duì)抗體要求也高。分子生物學(xué)診斷技術(shù)主要包括傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法以及熒光PCR方法，而傳統(tǒng)PCR方法只能對(duì)病毒感染定性，不能定量，靈敏度也較低；熒光定量PCR技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平分析、病原體的定性和定量檢測(cè)等方面得到廣泛的應(yīng)用。目前已有采用熒光定量PCR方法檢測(cè)牛群中呼腸孤病毒的報(bào)道，但由于該新型雞呼腸孤病毒系首次報(bào)道，針對(duì)哺乳動(dòng)物和其他禽類(lèi)的呼腸孤病毒診斷策略不能用于該新型雞呼腸孤病毒的檢測(cè)，迄今仍未有檢測(cè)該新型雞呼腸孤病毒的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)新型雞呼腸孤病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒及應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一組引物和探針，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2所示；所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。具體如下：

正向引物：M1-F：5’-ATGGCCTATCTAGCCACACCTG-3’；(SEQ ID NO.1)

反向引物：M1-R：5’-CAACGTGATAGCATCAATAGTAC-3’；(SEQ ID NO.2)