[發明專利]一種快速區分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR檢測引物組及試劑盒

在審

• 申請號: 201810493756.2
• 申請日: 2018-05-22
• 公開（公告）號: CN108796124A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 秦毅斌;盧冰霞;趙武;劉磊;何穎;陳忠偉;段群棚;周英寧;李斌;梁家幸;蘇乾蓮;閉炳芬;蔣冬福;盧敬專;李茂寧;侯韶毅
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚;何承鑫

本發明公開了一種快速區分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR檢測引物組及試劑盒，本發明屬于動物病毒學和分子生物學技術領域。該試劑盒包括SEQ ID1~6所示的引物序列，還包括了2×F8 Fastlong PCR MasterMix、cDNA模板和滅菌水。本發明提供的PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR檢測試劑盒采用多重PCR擴增，三種病變相似且同為DNA病毒的病毒一次檢測，檢測總時間控制在2小時左右，其檢測方法易于操作、方便快捷，能達到快速檢測的目的。

技術領域

本發明屬于動物病毒學和分子生物學技術領域，具體為針對豬圓環病毒1型、豬圓環病毒2型和豬圓環病毒3型一步法三重PCR的檢測引物組、檢測試劑盒及應用。

背景技術

豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）為一種共價閉合、單股環狀DNA病毒，是迄今發現最小動物病毒。2015年前，全球范圍內僅發現PCV1和PCV2兩個基因型。其中，PCV1被認為是豬腎細胞PK-15污染物，但不產生細胞病變效應，對豬無致病性。PCV2能引起豬圓環病毒相關疾病（PCVAD），主要有斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎和腎病綜合征（PDNS）、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）、繁殖障礙、增生性壞死性肺炎（PNP）和腸炎等。臨床上PCV2常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細小病毒(PPV)和豬肺炎支原體(M. hyo)等病原體混合感染。同時，感染PCV2后還容易繼發細菌感染，給養豬業造成巨大經濟損失。近年來PCV2流行毒株由PCV2a向PCV2b，繼而向PCV2d的轉變，病毒的致病力逐漸變強，對養豬業的危害加重。

2015年6月，美國北卡羅來納州某商品化豬場暴發PDNS疫情。患病母豬厭食、皮膚呈現多灶性丘疹、斑點和淺表性皮炎，所產胎兒(包括弱胎、死胎、木乃伊胎)具有相似臨床癥狀。Palinski等借助新一代測序(NGS)技術，從患病母豬及流產胎兒體內首次鑒定出一種新病毒，該病毒與圓環病毒科病毒具有類似基因組結構和遺傳相似性，但與其他圓環病毒衣殼蛋自氨基酸序列同源性低于70%，根據國際病毒分類委員會(ICTV)圓環病毒分類標準圈，將其歸類為一種新型圓環病毒，命名為PCV3。作為新動物病原體，PCV3對豬致病性和在PCVAD中作用以及現有商品化PCV2疫苗對其免疫效果等有待進一步研究。目前已有PCV3在美國、韓國、巴西、意大利、波蘭以及中國的華南、華中和華北多省市流行。

自20世紀90年代以來，PCV2便一直威脅著養豬業的發展，且近年來PCV2逐漸呈現出多亞型共同流行的趨勢，使PCV2防控更加困難。同時，PCV3的出現使豬圓環病毒病更加復雜化。PCV1雖然不產生病變,但廣泛存在于豬體內及豬的傳代細胞中，其存在可能會影響PCV2和PCV3的增殖及致病性。因此，研究建立一種特異、快速的PCV1/2/3多重PCR檢測方法，了解PCV1/2/3的流行情況，從而有效防控豬圓環病毒病的發生與流行，具有重要現實意義。

發明內容

本發明的目的是解決上述技術問題，提供一種快速區分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR檢測引物組及試劑盒，該試劑盒能夠快速區分PCV1、PCV2和PCV3，靈敏感高、特異性強，從而有效防控豬圓環病毒病的發生和流行。為實現本發明目的所使用的技術方案為：

一種快速區分PCV1、PCV2和PCV3的多重PCR檢測引物組，所述多重PCR檢測引物組包括PCV1檢測引物組、PCV2檢測引物組和PCV3檢測引物組；

所述PCV1檢測引物組由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO:2 所示核苷酸序列的下游引物組成；

所述PCV2檢測引物組由具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO:4 所示核苷酸序列的下游引物組成；

所述PCV3檢測引物組由具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ IDNO:6 所示核苷酸序列的下游引物組成。