[發(fā)明專利]一種固定化L-天冬氨酸α脫羧酶的方法及生產(chǎn)β-丙氨酸的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810493028.1
• 申請(qǐng)日: 2018-05-22
• 公開（公告）號(hào): CN108384775A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王東陽;于添池;劉樹立;陳正
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 王東陽
• 主分類號(hào): C12N11/08
• 分類號(hào): C12N11/08;C12P13/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種固定化L?天冬氨酸α脫羧酶的方法。所述方法步驟如下：配置L?天冬氨酸α脫羧酶緩沖溶液，活化樹脂交聯(lián)固化，得固定化L?天冬氨酸α脫羧酶。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)β?丙氨酸的方法，采用固定化L?天冬氨酸α脫羧酶為酶源制備而得。通過利用本發(fā)明獲得的固定化酶進(jìn)行生產(chǎn)獲得的產(chǎn)物純度高，容易分離；因此本發(fā)明在β?丙氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種固定化L-天冬氨酸α脫羧酶的方法，還涉及一種生產(chǎn)β-丙氨酸的方法，屬于生物技術(shù)生產(chǎn)氨基酸的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

β-丙氨酸是天然存在的唯一β型非蛋白氨基酸，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域；在醫(yī)藥產(chǎn)品方面主要用于合成泛酸、泛酸鈣、肌肽、巴柳氮和帕米磷酸鈉；在食品方面主要用于食品的營養(yǎng)添加劑。最早生產(chǎn)β-丙氨酸是主要依靠化學(xué)合成法，但是隨著對(duì)微生物法生產(chǎn)β-丙氨酸研究的深入，這種方法已經(jīng)走向?qū)嵱貌⑻幱谥鲗?dǎo)地位。微生物法可以分為發(fā)酵法、微生物轉(zhuǎn)化法和酶法合成法。其中酶法合成法是利用微生物泛酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶L-天冬氨酸α-脫羧酶催化L-天冬氨酸脫α位羧基生成β-丙氨酸。酶法生產(chǎn)β-丙氨酸具有產(chǎn)物濃度高、收率高、純度高、副產(chǎn)物少以及精制操作容易等優(yōu)點(diǎn)，是一種高效、廉價(jià)生產(chǎn)β-丙氨酸的方法。

2006年，郭恒華等報(bào)道了利用重組大腸桿菌菌株生產(chǎn)β-丙氨酸的方法。該技術(shù)以工程菌為酶源，不利于后續(xù)的分離純化，并且不能重復(fù)利用，成本相對(duì)較高。焦慶才(CN107012180A)等利用多酶偶聯(lián)轉(zhuǎn)化馬來酸制備β-丙氨酸的方法；該技術(shù)采用多酶體系偶聯(lián)催化，各種酶的最佳催化條件不同，導(dǎo)致酶活利用率低，底物轉(zhuǎn)化不徹底。因此，有必要提出有效的技術(shù)方案，解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)成本高、底物反應(yīng)不徹底的不足，提供一種固定化L-天冬氨酸α脫羧酶的方法及一種生產(chǎn)β-丙氨酸的方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

一種固定化L-天冬氨酸α脫羧酶的方法，所述方法步驟如下：

①配置L-天冬氨酸α脫羧酶緩沖溶液：將活性1000U/g～10000U/g的L-天冬氨酸α脫羧酶用質(zhì)量濃度為0.1mol/L的磷酸緩沖液溶解，再溶解溫度為4～10℃，制備出L-天冬氨酸α脫羧酶緩沖溶液；

所述L-天冬氨酸α脫羧酶緩沖溶液中L-天冬氨酸α脫羧酶活力為50U/mL；

②交聯(lián)固化：將活化樹脂置于反應(yīng)器中，溫度保持在0～10℃條件下，加入L-天冬氨酸α脫羧酶緩沖溶液，在攪拌下處理30～60min；待活化樹脂充分吸附酶并牢固結(jié)合后，加入戊二醛溶液，室溫下攪拌1～2h，過濾收集固定化酶，用10倍體積的去離子水洗滌3次，得固定化L-天冬氨酸α脫羧酶樹脂；在-80℃條件下冷凍干燥24h，4℃冰箱保藏備用；

所述活化樹脂的質(zhì)量與L-天冬氨酸α脫羧酶緩沖溶液的體積比為1g:(50～100)ml；活化樹脂的質(zhì)量與戊二醛溶液的體積比為1g:(5～10)ml。

優(yōu)選地，所述活化樹脂的制備方法包括：將樹脂用95％乙醇浸泡振蕩洗滌4h，用4％HCl振蕩洗滌1h，4％NaOH振蕩洗滌1h，得初級(jí)活化樹脂；將初級(jí)活化樹脂與濃度為10％的碳酸鈉溶液浸泡12h后，過濾，過濾出的樹脂用去離子水洗滌，然后將過濾洗滌后的樹脂按樹脂：NaCO₃：去離子水＝1:0.2～0.9:30～100的質(zhì)量比配成混合液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)混合液pH至9～12，攪拌條件下降溫至-5℃以下，加入固化劑保溫1h，得到活化樹脂。

優(yōu)選地，所述戊二醛溶液中戊二醛體積分?jǐn)?shù)5％～10％。

優(yōu)選地，所述樹脂為LKZ128樹脂、AB-8和ES-2樹脂中的一種。

優(yōu)選地，所述固化劑為溴化氰，加入量為樹脂質(zhì)量的0.5％～1％。