[發明專利]一種特異性靶向識別黑色素瘤耐藥細胞的核酸適體與試劑盒

有效

• 申請號: 201810490835.8
• 申請日: 2018-05-21
• 公開（公告）號: CN108707606B
• 公開（公告）日: 2021-12-28
• 發明（設計）人: 劉靜;荔輝;劉鵑;劉鳳;蕭小鵑;王梓;蔣雅雯
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/574;G01N33/53;A61K47/26
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所(普通合伙) 11039
• 代理人: 劉江良

本發明公開了一種特異性靶向識別黑色素瘤耐藥細胞的核酸適體與試劑盒。所述核酸適體序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，該核酸適體均能特異性且高親和力的靶向識別黑色素瘤耐藥細胞株及黑色素瘤耐藥細胞裸鼠異體移植瘤。目前，基于黑色素瘤耐藥細胞篩選核酸適體尚未有任何報道，利用本發明的核酸適體可為臨床耐藥黑色素瘤提供一種新的靶向藥物呈遞載體。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種特異性靶向識別黑色素瘤耐藥細胞的核酸適體與試劑盒。

背景技術

皮膚癌是皮膚細胞不受控制地異常增殖從而形成的惡性腫瘤，它是因皮膚細胞的DNA發生了不可修復的損傷（如基因突變，遺傳缺陷）而引起。皮膚癌可分為三種類型：基底細胞皮膚癌，鱗狀細胞皮膚癌與黑色素瘤（malignant melanoma, MM）。其中雖然黑色素瘤的發生比例僅占各類型皮膚癌的4%，但卻是惡性化程度最高的一類，易轉移，也是造成皮膚腫瘤相關死亡的主要原因。黑色素瘤在我國的發病率逐年增長，年增長率為3%~5%。大多數早期黑色素瘤患者可通過外科手術治愈，但患者往往術后發生轉移，預后差且5年內死亡率高。發生轉移的黑色素瘤一般以內科為主的綜合治療包括：①化療，如：達卡巴嗪、替莫唑胺等；②免疫治療，如：PD-1抑制劑、CTLA-4抑制劑等；③靶向治療，如：威羅菲尼、達拉菲尼等；④ 放射治療。

研究發現≥50%的黑色素瘤患者存在BRAFV600E突變，該突變可導致BRAF蛋白呈持續激活狀態，從而引起下游MAPK（mitogen-activated protein kinase）信號通路的持續激活，并最終導致癌細胞的存活與增殖。威羅菲尼（Vemurafenib, Plx4032）是一種特異靶向BRAFV600E的抑制劑，主要用于治療晚期BRAFV600E突變型的黑色素瘤患者。相比化療藥物，威羅菲尼具有出低毒性、患者耐受性高、快速的臨床應答等特點。約100%的患者對藥物的持續應答時間有限，中位無進展生存期（Progression free survival, PFS）約為5.1—6.8個月，而造成這一現象的原因在于腫瘤細胞對威羅菲尼產生了耐藥。因此，研發新型的針對威羅菲尼耐藥黑色素瘤的靶向治療或靶向藥物呈遞的策略，對黑色素瘤的治療具有重大醫學意義。

核酸適體（aptamer）在腫瘤早期診斷、治療及靶向藥物呈遞等諸多方面具有較大的應用前景。核酸適體是通過模擬自然進化過程的人工篩選技術-指數富集配體系統進化技術（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX）篩選與擴增得到的具有識別功能的短的單鏈DNA或RNA分子，能通過折疊形成特定的三維結構與多種類型的靶標高親和性、高特異性結合，包括有機染料、核苷酸、氨基酸、多肽、蛋白質、細胞、病毒和細菌。核酸適體除能與各種靶標分子高特異性、高親和力結合外，還具有分子量較小、低免疫原性、易合成、改造與標記、生物化學穩定性好、生物相容性好等多種優勢。細胞-SELEX（Cell-SELEX）是在SELEX 基礎上發展的一項新的細胞篩選技術，該技術篩選核酸適體是以活性細胞為篩選對象，無需事先了解靶目標的分子特征，能確保目標分子保持天然構象，最大程度保留其生物功能，該技術不僅可用于確定某種疾病或細胞的生物標志物，而且也非常有利于獲得具有治療潛力的核酸適體。到目前為止，基于細胞篩選核酸適體的工作已經在肺癌、肝癌、多發性骨髓瘤和白血病等多種細胞中開展。然而，基于威羅菲尼耐藥黑色素瘤細胞株篩選核酸適體尚未有報道。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種特異性靶向識別黑色素瘤耐藥細胞的核酸適體與試劑盒。

為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：

一種特異性靶向識別威羅菲尼耐藥黑色素瘤的核酸適體，所述核酸適體序列如SEQ ID NO.1所示，命名為核酸適體LL4。所述核酸適體的序列還可以是將核酸適體LL4的5'端9個堿基截去后所得的截短序列，截短序列如SEQ ID NO.2所示，命名為核酸適體LL4A，核酸適體LL4A與核酸適體LL4功能相同。

核酸適體LL4: