[發明專利]視網膜節細胞的制備方法

在審

• 申請號: 201810490491.0
• 申請日: 2018-05-21
• 公開（公告）號: CN110305846A
• 公開（公告）日: 2019-10-08
• 發明（設計）人: 陳舒怡;郝莉莉;王靜
• 申請（專利權）人: 中山大學中山眼科中心
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/85
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香

本發明提供一種視網膜節細胞的制備方法，包括如下步驟：獲取體細胞；構建慢病毒顆粒，用所述慢病毒顆粒轉染所述體細胞，從而將Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到體細胞染色體上；誘導培養，獲得視網膜節細胞。所得到的視網膜節細胞，通過將外源Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到小鼠成纖維細胞染色體上過表達制備獲得。與現有技術相比，本發明創造性地挑選Ascl1基因、Brn3b基因和Islet1基因的組合，通過慢病毒介導的方式使這三個轉錄因子在體細胞中過表達，能夠在誘導培養7天的情況下，實現超過10％的體細胞轉分化為Brn3a陽性、Tuj1陽性的視網膜神經節樣細胞，效率高。

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，特別是涉及一種視網膜節細胞的制備方法。

背景技術

自諾貝爾獎得主山中伸彌發現通過過表達Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc四個轉錄因子可以將體細胞重編程為多能干細胞(iPS)以來，人們陸續發現通過過表達組織特異性轉錄因子可以將體細胞直接重編程為其它譜系的體細胞，而無需經過多能干細胞階段(體細胞直接重編程)。2010年，美國的Marius Wernig實驗室發現同時過表達Ascl1，Brn2和Myt1l，可以將小鼠成纖維細胞高效地直接重編程為Tuj1陽性的神經元(Nature 2010，463：1035-41)。這一發現為再生治療神經退行性疾病開辟了嶄新，方便而快捷的供體細胞制備途徑。但是這一方法得到的神經元僅僅是普通的泛神經元，而治療各種神經退行性疾病需要針對此疾病的特定神經元亞型。為此，人們通過篩查不同的因子組合實現了體細胞直接重編程制備多巴胺神經元，運動神經元等神經元亞型的有效方法。但是當前尚缺乏體細胞直接重編程制備視網膜神經元的有效方法。

在發病率最廣泛的視網膜退行性疾病-青光眼中視網膜節細胞受到損害而永久丟失，導致視力不可逆喪失。視網膜節細胞移植治療有望解決青光眼不治之難題。因此建立體細胞直接重編程制備視網膜節細胞的方法具有巨大的臨床應用價值，但當前在此領域進展有限。雖然有報道，過表達Ascl1，Brn3b和Ngn2可以將小鼠成纖維細胞重編程為Brn3a陽性的視網膜節細胞樣細胞(Neuroscience 2013,250:381-93)，但是此報道中的方法獲得視網膜節細胞樣神經元的效率不夠高。

因此，亟待探索一種效率高的體細胞直接重編程制備視網膜節細胞的方法。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種視網膜節細胞的制備方法，該制備方法能夠高效的將體細胞直接重編程為視網膜節細胞。

本發明的技術方案是通過以下技術方案實現的：

一種視網膜節細胞，通過將外源Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到小鼠成纖維細胞染色體上過表達制備獲得。

一種視網膜節細胞的制備方法，包括如下步驟：

獲取體細胞；

構建慢病毒顆粒，用所述慢病毒顆粒轉染所述體細胞，從而將Ascl1基因、Islet1基因、Brn3b基因整合到體細胞染色體上；

誘導培養，獲得視網膜節細胞。

在其中一些實施例中，所述的體細胞為小鼠成纖維細胞。

在其中一些實施例中，所述慢病毒顆粒的構建包括如下步驟：

(1)獲取Ascl1基因的全長cDNA、Islet1基因的全長cDNA、Brn3b基因的全長cDNA；

(2)將所述Ascl1基因的全長cDNA、Islet1基因的全長cDNA、Brn3b基因的全長cDNA克隆到同一慢病毒載體上，獲得慢病毒表達質粒；

(3)用慢病毒表達質粒、誘導因子表達質粒、包裝質粒轉染包裝細胞，然后于包裝細胞的上清液中收集慢病毒顆粒。