[發明專利]用于無創檢測MITF基因突變的引物組合及檢測方法

有效

• 申請號: 201810480505.0
• 申請日: 2018-05-18
• 公開（公告）號: CN108531583B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 袁慧軍;譚博;程靜;卜楓嘯;盧宇
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 呂小琴

本發明涉及基因檢測領域，具體涉及用于無創檢測MITF基因突變的引物組合及檢測方法。所述引物組合包括核苷酸序列如Seq ID No.1?40所示的20對引物，用于特異性擴增MITF基因的不同區域，從而同時檢測MITF基因的變異。其中每一對引物用于擴增MITF基因中的一個區域，引物對之間包含的UMI分子標簽序列不同，用于保證來源于同一區域的DNA擴增片段中的UMI分子標簽序列相同，來源于不同區域的DNA擴增片段中的UMI分子標簽序列彼此不同。本發明的檢測方法，采用所述20對引物特異性擴增樣品中MITF基因的不同區域，利用UMI對擴增產物的二代測序數據進行降噪，從而準確檢測出低拷貝數變異。

技術領域

本發明涉及基因檢測領域，具體涉及用于無創檢測MITF基因突變的引物組合及檢測方法。

背景技術

基因突變的檢測對于許多種腫瘤檢測，胎兒遺傳狀態檢測都具有重要的價值。目前針對胎兒的基因突變篩查，主要基于SNP array等多個平臺系統，對胎兒及父母進行全基因組SNP分析，成本昂貴；而常規依賴聚合酶的邊合成邊測序難以保證堿基準確性，發生的堿基錯誤造成測序噪聲，因此常規文庫捕獲和高通量測序不能解決由擴增和測序造成的變異檢測偏差；而較新的循環單分子擴增和重測序技術(cSMART)受其環化文庫效率和背靠背引物位點的設計的影響。

孕婦外周血中胎兒來源的游離DNA的發現，為無創性檢測胎兒遺傳狀態提供了可能。孕婦外周血cfDNA源于母親和胎兒，胎兒游離DNA(cffDNA)來源于胎盤滋養層細胞，約占總cfDNA的10-20％，片段長度為140-180bp左右。將cffDNA從母親來源的DNA中鑒別出來仍然是目前的技術難點，特別是如何檢測母血血漿中cffDNA所導致的等位基因比例不平衡。目前國際上對cffDNA的研究主要通過位點特異性PCR，MALDI-TOF質譜法，數字PCR和高通量測序等方法進行。

目前主流的無創產前檢測方法均基于胎兒變異位點檢測和單體型檢測：通過對母血血漿中cfDNA進行位點檢測，然后利用相對變異劑量(RMD)和相對單體型劑量(RHDO)分析孕婦血漿中胎兒變異位點和單體型的相對含量。通過僅存在父親中的SNP推導了父源部分的胎兒基因組，母親來源的胎兒基因組部分則使用父親純合但母親雜合的SNP進行推導。Papasavva等利用該方法對母血cfDNA進行分析，成功對其cffDNA基因型和變異位點進行分析。因此利用對cffDNA中變異位點和單體型的檢測，可有效地提高胎兒致病基因的診斷準確度。

MITF(Microphthalmia-associtated transcription factor)基因(NCBI：mRNA序列號為NM_00248)全長4490bp，其中ORF編碼序列為1260bp，共有9個外顯子。其編碼蛋白是小眼畸形相關轉錄因子，在黑色素細胞的發育、分化和功能調節上起著重要作用，同時還參與了肥大細胞、破骨細胞和眼色素上皮細胞的發育和分化。MITF基因突變在臨床上會導致綜合征性耳聾，主要表現為感音神經性聾及色素異常，后者包括虹膜異色、白額發、早白發、皮膚色素減退或雀斑沉著；其他表現還有內眥異位、高寬鼻根、多毛癥、一字眉或眉毛中部潮紅等。利用基因檢測早期發現，早期干預，從而達到防殘減殘，提高人口素質的目的，對減輕患者家庭和社會的負擔意義重大。

因此，有必要針對MITF基因開發一種更加便捷和可靠的適合無創檢測低拷貝數基因突變的技術。

發明內容

根據上述領域存在的需求，發明人研發了一種無創檢測MITF基因突變的方法，在常規的多重擴增基礎上，向擴增引物中引入UMI(Unique Molecular Identifier)分子標簽，利用UMI對二代測序數據進行降噪，從而準確地檢測低拷貝數變異。

本發明請求保護的技術方案如下：

用于無創檢測MITF基因突變的引物組合，其特征在于：包括核苷酸序列如SeqIDNo.1-40所示的20對引物，用于特異性擴增MITF基因的不同區域，從而同時檢測MITF基因的變異及其臨近SNP位點。