[發明專利]一種用于眼表損傷修復的細胞植片及其制備方法

在審

• 申請號: 201810473890.6
• 申請日: 2018-05-17
• 公開（公告）號: CN108578778A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發明（設計）人: 朱君;鄧志宏
• 申請（專利權）人: 廣東芙金干細胞再生醫學有限公司
• 主分類號: A61L27/40
• 分類號: A61L27/40;A61L27/38;A61L27/22;A61L27/50;A61L27/56;A61L27/58
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1.一種用于眼表損傷修復的細胞植片，其特征在于：包括細胞膜片層（1）和纖維蛋白層（2）雙層結構，所述細胞膜片層（1）為由5～7層上皮細胞排列構成的厚度為50μm～150μm的膜結構，所述纖維蛋白層（2）為由纖維蛋白膠形成的厚度為200μm～500μm的疏松多孔的膜結構。

2.按照權利要求1所述的一種用于眼表損傷修復的細胞植片及其制備方法，其特征在于：所述上皮細胞為角膜上皮細胞、口腔黏膜上皮細胞、羊膜上皮細胞和由間充質干細胞分化的上皮細胞中的一種或多種的混合物。

3.一種制備如權利要求1所述的細胞植片的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟一、細胞膜片層（1）的制備，具體過程為：

步驟101、將上皮細胞接種在Transwell小室中進行細胞膜片培養；使用DMEM高糖培養基并每兩天換一次，培養15～20天后，細胞膜片形成；

步驟102、降低DMEM高糖培養基的液面至細胞膜片層（1）高度，進行氣-液界面培養，每天換一次DMEM高糖培養基，7天后，倒置顯微鏡觀察，形成了連續的上皮細胞層，細胞膜片層（1）培養結束；

步驟二、纖維蛋白層（2）的制備，具體過程為：

步驟201、去除Transwell小室中的DMEM高糖培養基后，再采用清洗液洗去殘留的DMEM高糖培養基；

步驟202、使用物質的量濃度為40mmol/L的CaCl₂溶液配制濃度為20U/ml～100U/ml的凝血酶溶液；

步驟203、使用純水配制質量-體積濃度為0.02g/ml～0.1g/ml的血纖維蛋白原溶液；步驟204、取步驟202中的凝血酶溶液0.5ml，步驟203中的血纖維蛋白原溶液0.5ml，將凝血酶溶液和血纖維蛋白原溶液同時均勻涂于細胞膜片層（1）上，等待2min～5min后，纖維蛋白膠凝固，纖維蛋白層（2）制備結束；

步驟三、將制備好的纖維蛋白層（2）與細胞膜片層（1）同時從Transwell小室的底面上緩慢揭下，制成了用于眼表損傷修復的細胞植片。

4.按照權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟101中所述Transwell小室的直徑為12mm，將上皮細胞接種在Transwell小室中的接種密度為2×10⁴個/cm²～1×10⁵個/cm²。

5.按照權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟101中進行細胞膜片培養時是在溫度為37℃、質量百分比濃度為5%的CO₂氣氛條件下進行的。

6.按照權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟101中所述DMEM高糖培養基中含有質量百分比濃度為10%的胎牛血清、質量-體積濃度為30mg/ml～70mg/ml的維生素C、質量-體積濃度為2ng/ml～5ng/ml的表皮生長因子、質量-體積濃度為10μg/ml～30μg/ml的牛腦垂體提取物和質量-體積濃度為2ng/ml～5ng/ml的亞硒酸鈉。

7.按照權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟201中所述清洗液為磷酸鹽緩沖液。