[發明專利]促進骨髓干細胞分化為肝細胞的細胞外基質的制備方法

在審

• 申請號: 201810473498.1
• 申請日: 2018-05-17
• 公開（公告）號: CN108546675A
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發明（設計）人: 劉文佳;李麗雅;明磊國;畢煥京;程蕊蘋;鄧志宏
• 申請（專利權）人: 廣東芙金干細胞再生醫學有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明實施例提供促進骨髓干細胞分化為肝細胞的細胞外基質的制備方法，涉及生物醫學領域，使制備的細胞外基質具有調節骨髓間充質干細胞微環境，誘導骨髓間充質干細胞向成熟肝細胞分化的優點。可用于在科研中研究肝病機理篩選藥物以及在臨床肝細胞移植治療肝病前準備肝細胞。所述促進骨髓干細胞分化為肝細胞的細胞外基質的制備方法包括：步驟一：準備豬肝細胞外基質；步驟二：患者自體骨髓間充質干細胞的分離和培養；步驟三：體外3D培養的骨髓間充質干細胞分化為肝細胞；步驟四：肝細胞的功能評價。

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，尤其涉及促進骨髓干細胞分化為肝細胞的細胞外基質的制備方法。

背景技術

每年世界上約有八十萬到一百二十萬人死于肝病，約占總死亡人次的1.3%-2%。中國作為肝病高發高傳染率的重災區，提供經濟有效的手段治療肝病是一項迫在眉睫的任務。肝病按照病理進程以及肝功能的變化可分為前期中期的肝纖維化和末期的肝硬化以及終末期導致的肝失代償，以乙肝為例，前期中期甚至末期抗病毒藥物能通過抑制病毒復制或有效緩解肝病。然而由于肝自身再生能力強，肝病前期中期表型不明顯，一旦查出為末期以后居多。

肝臟移植將健康肝臟通過外科手術移植入肝衰竭的病人體內，一直以來是臨床治療終末期肝病的主要甚至唯一的有效手段。然而有限的健康肝臟供給，昂貴的手術費用，限制了肝臟移植的應用。并且肝臟移植并不能徹底治愈患者，終身嚴重的免疫排斥，以及病人免疫抑制后的各種并發癥等等因素使術后病人延長平均5年最長至10到35年的壽命。

目前在研有望替代肝臟移植的療法為肝細胞移植。利用自體干細胞或者免疫原性弱的間充質干細胞分化成為肝細胞的話，可以解決移植后免疫排斥的問題。肝細胞移植的主要限制性環節在于體外獲取成熟的具有肝功能的細胞。間充質干細胞是成年人體內各個組織器官中都存在的干細胞，如脂肪間充質干細胞，骨髓間充質干細胞等。由于沒有倫理爭議，來源廣泛，容易獲取，且免疫原性極低，是體外分化肝細胞的最優選擇。如今促進間充質干細胞分化成熟肝細胞的方法多為添加一種或者各種高濃度的細胞因子，如最常用的肝細胞生長因子（HGF）。由于細胞因子價格昂貴，且這種方法分化肝細胞效率不高，分化而來的細胞代謝能力較正常肝細胞弱，直接限制了肝細胞移植療法的發展應用。

隨著對細胞分化研究的深入，人們發現肝組織來源的細胞外基質可以在很大程度上促進肝分化。細胞外基質上的膠原等可以作為信號響應并激活附著在細胞外基質上的細胞膜上的受體，從而激活細胞內的信號通路維持細胞穩態促進細胞在需要的時候生長分化。組織脫細胞后的并進行凍干處理的細胞外基質去除了免疫原性，主要留下膠原纖維附著有細胞因子復合體，并不需要額外添加細胞因子。因此使用脫細胞之后基本無免疫原性的細胞外基質，可以代替直接添加細胞因子的方法來促進間充質干細胞分化為肝細胞。

中國專利CN201510937399.0公開了一種可提高肝細胞體外分化表型及功能的培養方法。使用了肝細胞，肝源性間質細胞和細胞外基質接種到多孔蠶絲蛋白支架上并模擬肝細胞體外培養微環境進行培養。此發明顯著提高了分化得來的肝細胞功能，可以用于評價藥物對肝代謝酶的影響以及肝毒性檢測。然而肝細胞具有健全的表面抗原表達，肝源性間充質細胞的分離較其他來源的間充質干細胞又更加繁瑣且數量較少，加之要獲得人來源的肝組織細胞需要進行大創傷手術，因此，這種提高肝細胞體外分化表型及功能的方法不適用于肝細胞移植治療人的肝病，而更適宜作體外研究用途。中國專利CN201310203436.6發明了一種骨髓間充質干細胞自分泌細胞外基質并誘導其成為肝細胞的方法。使用由骨髓間充質干細胞所分泌的并且去除了骨髓間充質干細胞的基質，誘導效率高，分化效果好，誘導得到的肝細胞糖原合成能力和尿素合成能力強。然而骨髓間充質干細胞自分泌得到的細胞外基質的量較直接用模式動物組織脫細胞法制備的細胞外基質的量要少幾個數量級，且過程較為繁瑣耗時長費細胞，需先經骨髓間充質干細胞培養分泌細胞外基質，再分離細胞外基質，接著再次接種骨髓間充質干細胞誘導其分化成為肝細胞。因此，費用較使用細胞因子誘導肝細胞分化更為昂貴，不利于大規模生產應用。