[發(fā)明專利]一種人脂肪干細胞用的細胞凍存液

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810470079.2
• 申請日: 2016-03-06
• 公開（公告）號: CN108633875A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發(fā)明（設計）人: 李倩
• 申請（專利權）人: 李倩
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C07K7/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供了一種人脂肪干細胞凍存液及其制備方法。該細胞凍存液包括低密度脂蛋白，海藻糖，甘油，卵磷脂，多肽，bFGF，維生素E，還原性谷胱甘肽。本發(fā)明提供的細胞凍存液用于凍存人脂肪干細胞，特別是提高了凍存細胞復蘇后的存活率。具有較好的應用前景。

本發(fā)明是申請?zhí)枮椤?01710643072.1”、發(fā)明名稱為“一種人脂肪干細胞用的細胞凍存液”發(fā)明專利的分案申請。

技術領域

本發(fā)明涉及組織細胞培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種人脂肪干細胞凍存液及其制備方法和應用。

背景技術

脂肪干細胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞，具有可迅速擴增、不易衰老等一般干細胞的特點。人脂肪干細胞即人體脂肪間充質干細胞是目前廣泛應用于組織工程及再生醫(yī)學領域的一種成體干細胞與骨髓間充質干細胞一樣具有多向分化潛能。ADSCs呈成纖維細胞樣生長，胞漿和核仁豐富，呈平行或漩渦樣排列。細胞周期分析顯示G0/G1期的細胞占69％，S期占24％，G2/M期占8％。在胎牛血清的存在條件下傳代培養(yǎng)2-3天細胞增殖I倍。多次傳代(10-20代)后，細胞增殖速度無明顯減慢，在傳代6次后細胞群體中出現(xiàn)衰老細胞，第15代細胞群體中衰老細胞約占15％。

由于人脂肪間充質干細胞分離培養(yǎng)周期較長，原代細胞鋪滿的時間約2周以上，達到一定的數(shù)量需要3周左右。人脂肪間充質干細胞體外長期培養(yǎng)傳代容易發(fā)生自發(fā)分化，失去其多向分化的潛能。所以為保證實驗的連續(xù)性，必須隨時提供大量的實驗或組織工程用的種子細胞。因此，對于細胞的需求非常強烈。現(xiàn)在，將生產好的細胞進行冷凍保存，使用時再幾種解凍使用也是常規(guī)的使用模式。然而現(xiàn)有技術中干細胞凍存使用的凍存液有含血清和無血清的兩類，由于血清具有成分復雜、質量不穩(wěn)定、價格昂貴等缺點，無血清凍存和復蘇技術成為發(fā)展趨勢。低溫保存干細胞主要依靠抗凍液二甲基亞砜(DMSO)和血清的保護。常用到的細胞保護劑還有羥乙基淀粉0ES)、聚乙二醇(PEG)等。但是，DMSO會對細胞產生毒性作用，對凍存的干細胞造成不可逆的損傷。為獲得來源方便的神經干細胞，開展有效的神經干細胞凍存方法是本領域迫切的需求，建立一種長期低溫保存人脂肪干細胞的方法對于促進人脂肪干細胞的研宄和應用具有重大意義。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種人脂肪干細胞冷凍保存液以及相應的制備方法及使用方法。

紅果黃肉楠是一種小喬木，申請人經過研究發(fā)現(xiàn)，該植物中具有能夠耐寒冷的物質存在，因此，申請人通過高通量篩選獲得了相應的具有耐寒的多肽，因此，申請人嘗試將其加入到冷凍保存液中，用于保存細胞。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種人脂肪干細胞冷凍保存液，其特征在于由如下各組分組成：其特征是冷凍存液中含有:0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bFGF 1％w/v，維生素E 1％w/v，還原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用DMEM培養(yǎng)基定容至100ml，所述多肽的序列如SEQ ID NO：1-32任一所示。所述多肽有申請人通過前期的大量的基因庫篩選得到，所述多肽具有保護細胞免受損傷的功能。其名稱分別為KATS-1、KATS-2、KATS-3、KATS-4、KATS-5、KATS-6、KATS-7、KATS-8、KATS-9、KATS-10、KATS-11、KATS-12、KATS-13、KATS-14、KATS-15、KATS-16、KATS-17、KATS-18、KATS-19、KATS-20、KATS-21、KATS-22、KATS-23、KATS-24、KATS-25、KATS-26、KATS-27、KATS-28、KATS-29、KATS-30、KATS-31、KATS-32，其依次對應于SEQ ID NO：1-32。

在本發(fā)明的細胞的凍存液中，海藻糖以及維生素E和多肽具有明確的抵御外來傷害對細胞的損傷，特別是多肽，還具有保護細胞免受凍存時冰結晶對細胞的損傷。