[發明專利]一種快速分離田間稻瘟病斑上稻瘟菌單孢的方法

在審

• 申請號: 201810469205.2
• 申請日: 2018-05-16
• 公開（公告）號: CN108587929A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發明（設計）人: 楊俊;彭友良;趙文生;費利旺;蘆文博
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N1/02;C12N1/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

本發明公開了一種快速分離田間稻瘟病斑上稻瘟菌單孢的方法。本發明提供的方法，1)將含典型稻瘟病單病斑的水稻葉片涂布在水瓊脂培養基表面，得到帶有稻瘟菌分生孢子的水瓊脂板；2)培養所述帶有稻瘟菌分生孢子的水瓊脂板，再于體視顯微鏡下尋找單個且已萌發的稻瘟菌分生孢子，再分離該稻瘟菌單孢，得到含有稻瘟菌單孢的瓊脂塊；3)將所述含有稻瘟菌單孢的瓊脂塊轉移至番茄燕麥培養基培養，得到小菌落，在所述菌落周圍貼滅菌濾紙片，繼續培育至菌落長滿培養皿；收集帶菌的滅菌濾紙片，得到稻瘟菌單孢菌。本發明極大地縮短從田間稻瘟病斑上分離、保存稻瘟菌單孢的時間，對研究稻瘟菌群體無毒基因型的時空動態有重大的意義。

技術領域

本發明涉及一種快速分離田間稻瘟病斑上稻瘟菌單孢的方法，屬于植物保護領域。

背景技術

由稻瘟菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病是世界各水稻生產區內廣泛發生、且危害極大的一種真菌性病害。每年由稻瘟病造成的水稻產量損失約占其總產量的5％；在極端條件下，稻瘟病會造成水稻絕產。稻瘟菌可以侵染水稻的根、葉、穗等各個部位，在水稻整個生育期內均可侵染。此外，稻瘟菌寄主范圍非常廣泛，還可侵染大麥、小麥等禾本科植物。

目前防治水稻稻瘟病的主要措施有栽培抗稻瘟病品種和使用殺菌劑。一方面，國家在大力提倡綠色植保工程，需要減少殺菌劑的用量，采用環保的措施進行病害的防控。另一方面，由于田間稻瘟菌無毒基因的快速變異，能導致抗病水稻品種在推廣幾年后就失去抗性。因此，了解并掌握田間稻瘟菌無毒基因型的組成、分布及其變異規律，才能為抗病水稻品種的合理布局提供基礎，進而對稻瘟病進行綠色防控。為此，科研人員需要從田間分離大量的稻瘟菌單孢菌株，以便檢測不同稻瘟菌菌株的致病力、致病型和殺菌劑抗性等性狀。目前，現有的稻瘟菌單孢分離方法操作周期長、操作過程復雜、易受其它雜菌的污染，這些因素極大地制約了科研人員研究稻瘟菌群體無毒基因型時空動態的進度和水平。因此，急需要一種能快速地從田間稻瘟病斑上分離稻瘟菌單孢的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種從田間稻瘟病斑上分離稻瘟菌單孢的方法。

本發明提供的方法，包括如下步驟：

1)將含典型稻瘟病單病斑的水稻葉片(或者用剪刀剪下的含典型單病斑的適宜大小葉片)涂布(涂布采用的力道適中，避免孢子收集過密或過稀)在水瓊脂培養基表面，得到帶有稻瘟菌分生孢子的水瓊脂板；該步驟可以直接田間操作。

2)培養所述帶有稻瘟菌分生孢子的水瓊脂板，再于體視顯微鏡下尋找單個且已萌發的稻瘟菌分生孢子，再分離該稻瘟菌單孢，得到含有稻瘟菌單孢的瓊脂塊；

3)將所述含有稻瘟菌單孢的瓊脂塊轉移至番茄燕麥培養基培養，得到小菌落，在所述菌落周圍貼滅菌濾紙片，繼續培育至菌落長滿培養皿；收集帶菌的滅菌濾紙片，得到稻瘟菌單孢菌。

上述方法中，步驟1)中所述水瓊脂培養基還包含以下成分：50微克/毫升鹽酸四環素、20微克/毫升卡那霉素、50微克/毫升硫酸鏈霉素和20微克/毫升氯霉素。

上述方法中，步驟2)中所述體視顯微鏡的最大放大倍數不低于100倍。

上述方法中，所述體視顯微鏡的放大倍數為160倍。

上述方法中，步驟2)中，所述培養所述帶有稻瘟菌分生孢子的水瓊脂板的時間為2-3小時、培養溫度為26度，光照度為15000勒克斯；

或，所述分離稻瘟菌單孢的方式為劃“方形”瓊脂塊的方式，一般可在拖劃區域邊緣尋找到可供挑取的單個稻瘟菌孢子；且挑針劃線形成的“方形”瓊脂塊體積應越小越好，可降低雜菌污染概率。

上述方法中，步驟2)，若不能及時地進行分離稻瘟菌單孢，則將所述帶有稻瘟菌分生孢子的水瓊脂板置于4度冰箱中保存，可于一周內進行稻瘟菌單孢分離實驗。