[發明專利]一種根癌農桿菌介導川蔗23號遺傳轉化Bt基因的方法

無效

• 申請號: 201310030455.3
• 申請日: 2013-01-28
• 公開（公告）號: CN103103212A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 秦廷豪;李曉梅;安琪;陽翠
• 申請（專利權）人: 四川省植物工程研究院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 吳彥峰

技術領域

本發明涉及基因工程中對植物進行遺傳轉化的方法，特別是涉及根癌農桿菌介導植物遺傳轉化的方法，具體是一種根癌農桿菌介導甘蔗品種川蔗23號遺傳轉化Bt抗蟲基因的方法。

背景技術

甘蔗(Saccharum?officinarum?L.)是重要的糖能經濟作物，在世界各地廣泛栽植，其產糖量約占世界糖產量的60%～70%，在我國則占到90%以上。甘蔗大田生產的整個生長發育期內均會受到多種蟲害威脅，尤以鱗翅目害蟲——蔗螟（主要有條螟、二點螟、大螟、白螟、黃螟等）危害最大，以幼蟲蛀入甘蔗幼苗和蔗莖，導致甘蔗商品性、糖份等品質下降，并帶來每年20%～25%的損失。利用有性雜交技術培育抗蟲甘蔗品種是提高甘蔗抗蟲能力的重要途徑。但是，甘蔗是高度雜合的異源多倍體和多倍的非整倍體植物，遺傳背景十分復雜，利用傳統育種方法從有性雜交到良種育成要10～13年，周期長成效低。基因工程可以定向改變作物的某些性狀，為植物的育種開辟了新途徑。

Bt（cry1Ab）基因是從微生物蘇云金桿菌分離出的一種殺蟲結晶蛋白基因，是一種廣譜性的抗蟲基因，它指導合成的殺蟲結晶蛋白（ICP）。對許多鱗翅目、雙翅目及鞘翅目的昆蟲均有較強毒性。至1987年首次獲得轉Bt煙草植株以來，現已在許多植物的遺傳轉化中得以運用。

甘蔗的遺傳轉化研究首次報道始于1987年，目前成功培育出轉基因甘蔗的轉化方法有原生質體電穿孔法、基因槍法和農桿菌介導法等3種。農桿菌介導法簡便、易于操作，克服了基因槍法及電擊法等直接轉化法轉化效率低，轉化體嵌合體多、轉化外植體不易成活及拷貝數多的缺點，因此研究甘蔗農桿菌介導遺傳轉化對甘蔗遺傳工程改良有重要的理論與實踐意義。1998年，Arencibia等采用工程菌LBA4404和EHA101成功進行了農桿菌介導的甘蔗遺傳轉化，平均轉化率為0.194%～1.115%，開辟了甘蔗農桿菌介導法轉基因研究的先河。同年，Elliott使用工程菌株AGLO進行甘蔗轉基因研究，轉化效率為5.13%。此后國內外都相繼開展了農桿菌介導的甘蔗遺傳轉化研究。國內有關甘蔗遺傳轉化的研究較晚，王自章等、羅敬萍等、于蘭等、唐建平等先后通過根癌農桿菌介導法成功獲得了甘蔗的轉基因植株。

出乎預料的是，研究過程中發現按照現有技術中的甘蔗的遺傳轉化方法對自育甘蔗品種川蔗23號的進行遺傳轉化，幾乎無法實現，而到目前為止還沒有見到對特定的川蔗23號進行遺傳轉化的報道。本領域公知，影響農桿菌遺傳轉化甘蔗的因素很多，如甘蔗的基因型、受體材料類型、農桿菌株系、菌體濃度、乙酰丁香酮（AS）濃度、浸染時間、共培養時間等。經過長時間的研究發現，對于川蔗23號而言，菌體濃度與浸染時間是影響轉化效率的關鍵因素。在較高菌液濃度與較長浸染時間的條件下可導致受體胚性愈傷組織在篩選培養基上因農桿菌過度增殖而污染死亡，其污染死亡率高達90%以上，從而進一步導致轉化無法實現。本發明的方法大大降低了川蔗23號胚性愈傷組織的污染率并成功實現其遺傳轉化Bt抗蟲基因。

發明內容

本發明的目的是提供一種根癌農桿菌介導甘蔗品種川蔗23號遺傳轉化Bt抗蟲基因的方法，可以顯著降低川蔗23號胚性愈傷在轉基因過程中因農桿菌過度增殖而污染死亡的現象，并成功實現其遺傳轉化。本發明具體包括如下步驟：

獲得川蔗23號遺傳轉化所需受體胚性愈傷組織；預培養及預處理胚性愈傷組織；攜帶有植物表達載體及目的基因的農桿菌工程菌液的制備；工程菌液浸染胚性愈傷組織；胚性愈傷組織與農桿菌共培養；抗性愈傷、抗性芽及抗性小苗篩選培養；抗性植株PCR檢測。

所述的胚性愈傷組織是以川蔗23號的幼嫩葉鞘為外植體，經(常規)滅菌后切成幼葉卷(厚度為0.3cm左右)，接種于胚性愈傷誘導培養基上，25℃黑暗培養，誘導胚性愈傷組織。胚性愈傷誘導培養基以MS為基本培養基并添加1～2mg·L^-1的2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）與0～50mg·L^-1的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。受體材料以誘導40～50d呈淡黃色、結構疏松、顆粒狀、胚性一致的愈傷組織為轉化最佳受體。

所述的預培養是將胚性愈傷轉入胚性愈傷誘導培養基中，于25℃黑暗培養3～4d。預處理是將胚性愈傷于浸染前在超凈工作臺風干處理30～45min，至其微微干縮。