[發明專利]一種根癌農桿菌介導川蔗23號遺傳轉化Bt基因的方法

無效

• 申請號: 201310030455.3
• 申請日: 2013-01-28
• 公開（公告）號: CN103103212A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 秦廷豪;李曉梅;安琪;陽翠
• 申請（專利權）人: 四川省植物工程研究院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 吳彥峰

1.一種根癌農桿菌介導川蔗23號遺傳轉化Bt基因的方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）胚性愈傷組織的獲取：以川蔗23號的幼嫩葉鞘為外植體，經滅菌后切成幼葉卷，接種于胚性愈傷誘導培養基上，25℃黑暗培養，誘導胚性愈傷組織；

（2）胚性愈傷組織的預培養及預處理胚性：將胚性愈傷組織轉入胚性愈傷誘導培養基中，于25?℃黑暗培養3～4?d；然后將胚性愈傷組織于浸染前在超凈工作臺風干處理30～45?min，至其微微干縮；

（3）攜帶有植物表達載體及目的基因的農桿菌工程菌液的制備：挑取攜帶pCAMBIA1301質粒與目的基因Bt的農桿菌菌株EHA105單菌落于農桿菌培養基上劃線培養，48～72?h后刮取長0.5～1.0?cm的菌體，懸浮于農桿菌活化培養基內，其OD₆₀₀為0.1，再置于28?℃，180?rpm條件下振蕩培養2?h，以誘導農桿菌vir基因的活化表達，此菌液即為轉化工程菌液；

（4）工程菌液浸染胚性愈傷組織：將預處理的胚性愈傷組織浸沒于工程菌液中感染1.5～2?min，轉到濾紙上吸干多余菌液；

（5）胚性愈傷與農桿菌共培養：將浸染的胚性愈傷組織轉入共培養培養基中，于23?℃黑暗培養3～4?d；

（6）抗性愈傷、抗性芽及抗性小苗篩選培養：將共培養后的胚性愈傷組織用無菌水清洗至無渾濁后，用含有羧芐青霉素(Car)?500?mg·L^-1的無菌水浸泡2?min，再用無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干后，接種于抗性胚性愈傷篩選培養基上，25?℃黑暗培養15～20d，轉入抗性芽篩選培養基上，25?℃，2000?lx光照強度下培養以誘導芽的形成，當抗性芽長至5?cm左右時，轉入生根篩選培養基上以篩選抗性完整植株；

（7）抗性植株PCR檢測。

2.如權利要求1所述的一種根癌農桿菌介導川蔗23號遺傳轉化Bt基因的方法，其特征在于：所述胚性愈傷誘導培養基以MS為基本培養基并添加1～2?mg·L^-1的2,4-D與0～50?mg·L^-1?的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

3.?如權利要求1或2所述的一種根癌農桿菌介導川蔗23號遺傳轉化Bt基因的方法，其特征在于：步驟（1）誘導培養時間為40～50?d，選取淡黃色、結構疏松、顆粒狀、胚性一致的愈傷組織進行步驟（2）的操作。

4.?如權利要求1或2所述的一種根癌農桿菌介導川蔗23號遺傳轉化Bt基因的方法，其特征在于：所述農桿菌培養基以YEP為基本培養基并添加50mg·L^-1的卡那霉素（Kan）、50mg·L^-1的利福平（Rif）和15?g·L^-1的瓊脂（Agar），所述農桿菌活化培養基以AAM為基本培養基并添加100～150μm·L^-1的AS。

5.如權利要求1或2所述的一種根癌農桿菌介導川蔗23號遺傳轉化Bt基因的方法，其特征在于：所述培養基以胚性愈傷誘導培養基并添加100～150μm·L^-1的AS。

6.如權利要求1或2所述的一種根癌農桿菌介導川蔗23號遺傳轉化Bt基因的方法，其特征在于：所述抗性胚性愈傷篩選培養基為胚性愈傷誘導培養基并添加潮霉素（Hyg）20～30?mg·L^-1+Car?300～500?mg·L^-1。

7.如權利要求1或2所述的一種根癌農桿菌介導川蔗23號遺傳轉化Bt基因的方法，其特征在于：所述抗性芽篩選培養基以MS為基本培養基并添加6-BA?1.0～2.0?mg·L^-1+NAA?0.1～0.5?mg·L^-1+Hyg?20～30?mg·L^-1+Car?300～500?mg·L^-1+PVP?0～50?mg·L^-1。

8.如權利要求1或2所述的一種根癌農桿菌介導川蔗23號遺傳轉化Bt基因的方法，其特征在于：所述生根篩選培養基為1/2?MS+?NAA?1.0～2.0?mg·L^-1+Hyg?20～30?mg·L^-1+Car?300～500?mg·L^-1。

9.如權利要求1或2所述的一種根癌農桿菌介導川蔗23號遺傳轉化Bt基因的方法，其特征在于：所述的PCR分子檢測是根據Bt（Cry1Ab）序列合成反應引物，分別以潮霉素抗性植株的DNA、對照甘蔗植株的DNA及質粒DNA為模板，進行PCR擴增檢測。