[發明專利]crRNA介導的CRISPR/Cas13a基因編輯系統在腫瘤細胞中的應用

有效

• 申請號: 201810465791.3
• 申請日: 2018-05-16
• 公開（公告）號: CN108546718B
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發明（設計）人: 康春生;王琦雪;周俊虎
• 申請（專利權）人: 康春生
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/113
• 代理公司: 天津市尚儀知識產權代理事務所(普通合伙) 12217
• 代理人: 鄧琳

本發明公開了一種crRNA介導的CRISPR/Cas13a基因編輯系統在腫瘤細胞中的應用。本發明的Cas13a蛋白在U87膠質瘤細胞系中，可以由單鏈的crRNA介導到互補的目的RNA上，并進行切割。同時，Cas13a蛋白還能夠在真核生物細胞中觸發連帶剪切的效應，即在開始切割第一條目的RNA之后，Cas13a蛋白對其他遇到的RNA，進行無目的的隨機切割，從而起到降低腫瘤細胞指數，抑制小鼠成瘤率和腫瘤大小等抑制和殺傷腫瘤的作用。本發明提供了一種抑制或殺傷腫瘤細胞的新方法，為CRISPR?Cas13系統隨機剪切效應在真核細胞中的應用奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及DNA重組技術，更具體地是一種crRNA介導的CRISPR/Cas13a基因編輯系統在腫瘤細胞中的應用。

背景技術

短回文重復序列(Clustered regularly interspaced shot palindromicrepeat，CRISPR)和CRISPR相關蛋白(CRISPR-associated proteins，Cas)是古生菌和細菌的獲得性免疫系統。Cas蛋白主要分為兩大類：獲得性模塊(adaptation module)和效應模塊(effector module)。獲得性模塊可以將外源核酸信息導入CRISPR序列中，并生成CRISPRRNAs(crRNAs)，作為系統的向導。效應模塊在crRNA的介導下，剪切外源入侵的核酸。在CRISPR-Cas系統中，獲得性模塊相似度較高，主要包括Cas1和Cas2。相比之下，效應系統的種類較多，根據亞基的數量，主要分為1級系統(Class 1systems,C1)和2級系統(Class2systems,C2)。C1系統是由多個蛋白的復合物結合在一起，共同行使功能的，包括I型，III型和IV型；C2系統則由單獨Cas蛋白發揮作用，包括II型和V型。II型CRISPR系統主要使用RuvC和HNH內切酶結構域行使功能，V型CRISPR系統則使用單獨的RuvC內切酶結構域，包括Cpf1,C2c1和C2c3等。這些系統都是靶向DNA的。VI型CRISPR系統由單獨的C2c2效應蛋白組成，這一蛋白沒有脫氧核糖核酸酶結構域，但是有兩個核酸酶結構域(Higher Eukaryotesand Prokaryotes Nucleotide-binding domain,HEPN)。因此，C2c2是由RNA介導的靶向RNA的CRISPR效應器，并且是一個單分子的內切核糖核酸酶。進一步的報道證明，C2c2是一個由crRNA介導的單鏈RNA(ssRNA)內切酶。C2c2的靶向切割既取決于靶向序列，又取決與序列的二級結構。在離體實驗中，C2c2-crRNA復合體在被靶向RNA激活并開始剪切后，還能夠非特異性的剪切其他RNA。這一系統的特性被應用為體外的核酸檢測。同時，來源于Leptotrichia shahii的Cas13a，以其更為高效的RNA酶切活性得到了使用。然而目前在真核生物中，對于Cas13a相關應用的研究基本尚未開始，對于CRISPR/Cas13a系統在真核和腫瘤細胞中的應用，必將產生巨大的價值。

發明內容

本發明為了解決CRISPR/Cas13a系統在真核和腫瘤細胞中應用較少的問題，所提出一種crRNA介導的CRISPR/Cas13a基因編輯系統在腫瘤細胞中的應用。

本發明是按照以下技術方案實現的。

crRNA介導的CRISPR/Cas13a基因編輯系統在腫瘤細胞中的應用。

進一步的，所述CRISPR/Cas13a基因編輯系統在腫瘤細胞中通過觸發隨機剪切效應抑制或殺傷腫瘤細胞。

進一步的，所述腫瘤細胞為膠質瘤細胞系、膠質瘤突變型細胞或人腎癌細胞系。

進一步的，所述膠質瘤細胞系為人U87細胞、人LN229細胞系或小鼠GL261細胞系；所述膠質瘤突變型細胞為U87EGFR VIII細胞；所述人腎癌細胞系為人ACHN細胞系。

進一步的，所述Cas13a基因在腫瘤細胞中的表達載體為質粒表達載體或病毒表達載體。