[發(fā)明專利]一種巢式PCR檢測(cè)試劑盒及其在黃櫨枯萎病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810463409.5
• 申請(qǐng)日: 2018-05-15
• 公開（公告）號(hào): CN108315392A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周江鴻;夏菲;車少臣
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京市園林科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/6848
• 分類號(hào): C12Q1/6848;C12Q1/6895;C12Q1/04
• 代理公司: 北京格允知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11609
• 代理人: 譚輝;周嬌嬌

1.一種巢式PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

(1)用于第一輪PCR擴(kuò)增的引物P1和引物P2；

(2)用于第二輪PCR擴(kuò)增的引物PN1和引物PN2；

其中，在以黃櫨枯萎病菌(Verticillium dahliae)基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，所述引物P1在與所述引物P2配對(duì)作為引物時(shí)具有與如SEQ ID NO.1所示的引物序列相同的作為引物的功能；在以黃櫨枯萎病菌(Verticillium dahliae)基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，所述引物P2在與所述引物P1配對(duì)作為引物時(shí)具有與如SEQ ID NO.2所示的引物序列相同的作為引物的功能；并且

在以黃櫨枯萎病菌(Verticillium dahliae)基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，所述引物PN1在與所述引物PN2配對(duì)作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)具有與如SEQ ID NO.3所示的引物序列相同的作為引物的功能，所述引物PN2在與引物PN1配對(duì)作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)具有與如SEQ ID NO.4所示的引物序列相同的作為引物的功能。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：

所述引物P1為能夠以所述黃櫨枯萎病菌基因組DNA為模板與所述引物P2配對(duì)作為引物通過PCR擴(kuò)增出第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物，并且所述引物P2為能夠以所述黃櫨枯萎病菌基因組DNA為模板與所述引物P1配對(duì)通過PCR擴(kuò)增出所述第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，所述第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為由SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.2所示序列配對(duì)作為引物并以所述黃櫨枯萎病菌基因組DNA為模板通過PCR擴(kuò)增得到的序列；所述引物PN1能夠以所述第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板與所述引物PN2配對(duì)作為引物通過PCR擴(kuò)增出第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物，并且所述引物PN2能夠以所述第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板與所述引物PN1配對(duì)通過PCR擴(kuò)增出所述第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，所述第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物為由SEQ ID NO.3所示序列和SEQ ID NO.4所示序列配對(duì)作為引物并以所述第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板通過PCR擴(kuò)增得到的序列；

優(yōu)選的是，所述引物P1包含如SEQ ID NO.1所示的序列，更優(yōu)選為由SEQ ID NO.1所示的序列組成；和/或所述引物P2包含如SEQ ID NO.2所示的序列，更優(yōu)選為由SEQ ID NO.2所示的序列組成；和/或所述引物PN1包含如SEQ ID NO.3所示的序列，更優(yōu)選為由SEQ IDNO.3所示的序列組成；和/或所述引物PN2包含如SEQ ID NO.4所示的序列，更優(yōu)選為由SEQID NO.4所示的序列組成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：

(3)PCR反應(yīng)緩沖液；

(4)dNTPs；

(5)Taq酶；

(6)無(wú)菌水。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：

所述PCR反應(yīng)緩沖液為10倍PCR擴(kuò)增用濃度；更優(yōu)選的是，所述PCR反應(yīng)緩沖液含有Tris-HCl、MgCl₂和KCl；優(yōu)選的是，所述PCR反應(yīng)緩沖液的組成如下：100mM的pH為8.3的Tris-HCl緩沖液、15mM MgCl₂和500mM KCl。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：

所述dNTPs是濃度不低于2.5mmol/L的dNTPs混合液；

所述Taq酶是濃度不低于5U/μL的Taq酶溶液；

所述引物P1、P2、PN1和PN2各自獨(dú)立地為濃度不低于10μmol/的引物溶液。

6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)黃櫨枯萎病菌(Verticilliumdahliae)中的應(yīng)用。

7.一種檢測(cè)黃櫨枯萎病菌的方法，其特征在于，所述方法采用權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。