[發明專利]一種鎳摻雜的有序介孔氧化鋁及固定化果糖基轉移酶的制備方法

有效

• 申請號: 201810463193.2
• 申請日: 2018-05-15
• 公開（公告）號: CN108642036B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 陳杰博;王璐;李嘉偉
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C01F7/02
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

本發明公開了一種鎳摻雜的有序介孔氧化鋁及固定化果糖基轉移酶的制備方法，屬于生物工程技術領域。所述固定化果糖基轉移酶制備方法包括：（1）鎳摻雜的有序介孔氧化鋁載體的合成；（2）通過鋁與氨基酸的配位，將果糖基轉移酶固定于載體上；（3）通過鎳的激活，提高固定化酶的酶活性。該方法由于制備條件溫和，酶與載體間的作用力為配位鍵，作用力強，酶不容易脫落，同時，由于鎳的激活作用，酶能夠保持較高的活性，介孔結構的載體，有利于底物快速到達反應位點，實現了果糖基轉移酶高活性和牢固的固定化之間的平衡。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種鎳摻雜的有序介孔氧化鋁體及固定化果糖基轉移酶的制備方法。

背景技術

低聚果糖又稱為蔗果三糖族低聚糖，是蔗糖分子的果糖殘基上通過β1-2-糖苷鍵連接1-3個果糖基而形成的果糖寡聚糖：蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其它混合物。低聚果糖具有水溶性膳食纖維的功效，是一種益生元，可促進雙歧桿菌的生長、減少有害菌、促進礦物質的吸收、增強身體免疫力、抗癌、降血糖及預防齲齒等作用，并且無任何毒副作用。低聚果糖廣泛存在于大麥、西紅柿、香蕉等植物中，但含量低，開發難度大。

果糖基轉移酶能催化蔗糖轉化為蔗果低聚糖，但該酶易溶于水，價格昂貴，生產過中從底物中分離困難，只能利用一次，造成生產成本極高，無法實現工業化應用。因此，將果糖基轉移酶固載于不溶于水的載體上，使得固定化的酶極易與底物、產物分離，產物溶液中沒有酶的殘留，提純工藝簡化，能實現連續反應，便于自動化生產，因此，果糖基轉移酶的固定化成為研究的熱點。已有報道的固定化載體包括大孔樹脂、殼聚糖等高分子材料，羥基磷灰石、磁性氧化鐵、活性炭、分子篩、氧化硅等無機材料，這些材料主要通過氫鍵、離子鍵、共價鍵的作用力與酶結合，氫鍵和離子鍵由于作用力弱，容易造成酶的脫落，而共價鍵雖然作用力很強，但是需要載體與酶作用，合成過程中的條件苛刻，容易造成酶失活。各種固定化酶方法有各自的優缺點，如何平衡酶的活性與穩定性，是固定化酶應用需要解決的關鍵科學問題。因此，設計合成能溫和固定化、反應活性高、性質穩定的載體，成為固定化酶工業化應用的關鍵。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用配位鍵溫和固定化果糖基轉移酶的鎳摻雜的有序介孔氧化鋁的制備方法，解決果糖基轉移酶固定化體系中酶的高活性和穩定固定化難以兼得的問題。

為實現上述目的，本發明采用以技術方案：

一種鎳摻雜的有序介孔氧化鋁的制備方法，包括以下步驟：

1）室溫下，將P123（聚乙烯醚-聚丙烯醚-聚乙烯醚嵌段共聚物）溶解在無水乙醇中，得到P123的無水乙醇溶液；

2) 將異丙醇鋁和硝酸鎳加入到P123的無水乙醇溶液中，加入濃鹽酸，充分攪拌溶解后，攪拌5-12h，形成溶膠；

3）將上述溶膠于55-65℃下溶劑揮發自組裝45-50h，得到干凝膠，將干凝膠以1.8-2.2℃/min的速率升溫至480-500℃，保持3.5-4.5h，即得鎳摻雜的有序介孔氧化鋁載體。

進一步，所述聚乙烯醚-聚丙烯醚-聚乙烯醚嵌段共聚物、異丙醇鋁、硝酸鎳的質量比為1∶1-4∶0.01-1，優選為1∶1-4∶0.01-0.25。

采用鎳摻雜的有序介孔氧化鋁為載體的固定化果糖基轉移酶的制備方法：將果糖基轉移酶溶解于pH 6-8的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液中，配制成濃度10mg/mL的酶液，將每10-90mg鎳摻雜的有序介孔氧化鋁加入10mL水中，超聲15-25 min，加入0.1-0.9mL酶液，放入搖床中反應22-26h，棄去上清液，固體顆粒用pH為4.5-6.0的 0.05mol/L檸檬酸-磷酸緩沖液沖洗2-3次，即得固定化果糖基轉移酶。

本發明采用以上技術方案，首先制備鎳摻雜的有序介孔氧化鋁載體，通過鋁與氨基酸的配位，將果糖基轉移酶固定于載體上，通過鎳的激活，提高固定化果糖基轉移酶的酶活性。