[發明專利]一種檢測人類胚胎α-地中海貧血基因突變的引物組合及方法

在審

• 申請號: 201810461176.5
• 申請日: 2018-05-15
• 公開（公告）號: CN108531582A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 鄧紅輝;盧紹月;方雅亮
• 申請（專利權）人: 廣州達瑞生殖技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測人類胚胎α-地中海貧血基因突變的引物組合，其特征在于：所述引物組合由SEQ ID NO：1～1354所示序列的多重PCR引物組成。

2.一種基于高通量測序平臺檢測α-地中海貧血基因突變的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)胚胎細胞全基因組擴增和夫妻雙方全血DNA提取：將獲自體外培養的囊胚的滋養層細胞經全基因組擴增對細胞中的基因組DNA進行富集，和全血DNA提取，得到DNA后進行濃度測定；

(2)目的片段擴增：將DNA與多重PCR引物和PCR擴增試劑混合，經多重PCR反應，得到目的基因DNA片段；

(3)引物消除：將步驟(2)得到的DNA片段與引物消除試劑混合反應，降解去除PCR擴增片段中的引物序列，得到去引物的DNA片段；

(4)接頭連接：將步驟(3)得到的DNA片段與P1接頭、特異性接頭、連接反應試劑混合進行連接反應，得到加接頭的DNA片段；

(5)磁珠純化：將加接頭的DNA片段進行磁珠純化，去除多余的小片段接頭，得到純化的DNA片段；

(6)文庫擴增：將步驟(5)的DNA片段加入文庫擴增反應液及文庫擴增引物進行PCR擴增，并采用磁珠進行純化，得到小片段的DNA文庫；

(7)文庫檢測：將步驟(6)得到的文庫采用熒光定量PCR的方法檢測文庫濃度；

(8)高通量測序：采用Ion Proton或Ion PGM測序平臺對步驟(7)得到的文庫進行高通量測序；

(9)生物信息學分析：對胚胎活檢細胞全基因組擴增WGA產物(DNA)及家系樣本進行捕獲測序進行生物信息學SNP分析，獲得夫婦及致病基因連鎖單倍型信息，再根據胚胎樣本的測序信息判斷是否遺傳了父母親的致病單體型。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟(2)中所述的多重PCR反應條件如下：

99℃預變性2min，1個循環；99℃變性15sec，60℃退火和延伸4min，22個循環；10℃終止。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟(4)中所述的P1接頭如下：

5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’和

5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’；

所述特異性接頭是由如下正反兩個序列組成的Barcode x：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’和5’-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC-3’，Barcode x代表的具體序列如下：

Barcode 1：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3’

5’-ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 2：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCTCCTTACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 3：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT-3’

5’-ATCGAATCCTCTTCTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 4：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGAT-3’

5’-ATCGATCTTGGTACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 5：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCCTTCTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 6：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGAT-3’

5’-ATCGAACTTCTTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 7：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGAT-3’

5’-ATCGAATCACGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 8：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGAT-3’

5’-ATCGTTATCGGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 9：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCCGCTCACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 10：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGACCGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCGGTCAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 11：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCTCGAATCGAT-3’

5’-ATCGATTCGAGGACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 12：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGGTGGTTCGAT-3’

5’-ATCGAACCACCTACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 13：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAACGGACGAT-3’

5’-ATCGTCCGTTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 14：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTGGAGTGTCGAT-3’

5’-ATCGACACTCCAACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 15：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAGAGGTCGAT-3’

5’-ATCGACCTCTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 16：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTGGATGACGAT-3’

5’-ATCGTCATCCAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟(6)中所述的PCR擴增反應條件如下：

98℃預變性2min，1個循環；98℃變性15sec，60℃退火和延伸1min，5～7個循環；10℃終止。