[發明專利]基于適配體磁捕獲和直接LAMP的福氏志賀菌可視化檢測方法

在審

• 申請號: 201810452124.1
• 申請日: 2018-05-12
• 公開（公告）號: CN108611402A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 馮俊麗;田小蘭;沈清
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04;C12Q1/6806
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發明公開了一種基于適配體磁性捕獲和直接LAMP反應的福氏志賀菌可視化檢測方法，該方法提供了核酸適配體以及LAMP反應所用的引物F3、B3、FIP、BIP；該方法包括以下步驟：制備偶聯適配體的磁珠溶液；目標菌的磁性捕獲；菌體DNA模板的制備；LAMP反應；LAMP反應結束后，使所得的反應液與SYBRI指示劑相混合；如果反應液顏色變為綠色，可判定結果為陽性；如果反應液顏色變為橙色，可判定結果為陰性。本發明的福氏志賀菌檢測方法具有快速高效、操作簡便、特異性強、靈敏度高、適合現場檢測等優點，為福氏志賀菌的現場檢測提供了新的技術支撐。

技術領域

本發明屬于食源性致病菌分子生物學檢測技術領域，涉及福氏志賀菌基于核酸適配體的磁性捕獲和基于直接LAMP反應的可視化檢測方法。

背景技術

志賀氏菌(Shigella)為一類具有高度傳染性和危害嚴重的革蘭氏陰性桿菌，也是人類細菌性痢疾最為常見的病原菌，通常稱為痢疾桿菌。人類對志賀氏菌普遍易感，據報道每年全球有1.6億人患病，約有110萬人死亡，絕大多數為5歲以下兒童。在人群密集區，志賀氏菌引起的痢疾爆發和傳播速度很快并且難以控制，常常是群體性食物中毒的罪魁禍首。根據其抗原構造不同，志賀氏菌可分為四個主要類群：痢疾志賀菌、福氏志賀菌、鮑氏志賀菌和宋內氏志賀菌。這四個群中，福氏志賀菌是發展中國家(如中國)的主要流行群。

我國自2005年開始，在全國范圍內開展了菌痢的監測，福氏志賀菌的報告病例數一直高居全國法定傳染病的前5位，由該菌所引起的痢疾占總發病率的70％。目前，志賀氏菌檢測的國家標準為微生物檢測法：包含富集、分離、純化和鑒定等步驟。這種檢測方法通常需要將抽查樣品帶回實驗室，通過3-7天甚至更長時間才能完成整套檢測，既費時費力，又較繁瑣，無法滿足大量樣品快速篩選的要求；此外，志賀氏菌在人體外的存活力較差，只有小部分志賀氏菌可被檢測。為了克服傳統檢測方法的局限，PCR、熒光定量PCR及分子雜交技術已應用于志賀氏菌的檢測。這些分子診斷技術雖具有敏感性及特異性強、可大批量檢測及避免主觀偏差等優點，部分解決了快速檢測的需求，但由于試驗過程需要專業技術人員及PCR基因擴增儀、雜交儀等昂貴的儀器設備而造成一定的局限性，在實際現場應用中還存在許多困難，難以在基層或者貧困地區推廣。因此，開發簡便、快捷、靈敏的福氏志賀菌可視化現場檢測技術十分必要。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification method，LAMP)是2000年由日本Notomi等人發明的一種等溫擴增技術，它起源于核酸擴增原理，針對目的基因的6個區域設計特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase largefragment)的作用下，通過65℃保溫1h實現靶基因的高效擴增。LAMP技術最大的優勢還在于擺脫了對貴重儀器設備的依賴，僅僅靠普通水浴鍋或金屬浴即可完成檢測。近年來，人們將LAMP技術進行了改良，在反應前加入染料對擴增結果進行顯色，不需要開蓋檢測，可直接通過肉眼判斷檢測結果，真正實現了可視化檢測。這項改進使得LAMP技術具有良好的現場、野外檢測及資源有限的基層實驗室檢測應用前景。