[發明專利]一種循環腫瘤細胞及團簇陰性分離的微流控裝置和方法

在審

• 申請號: 201810449308.2
• 申請日: 2018-05-11
• 公開（公告）號: CN108671971A
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發明（設計）人: 趙亮;蔣海祥;劉楊;張學記
• 申請（專利權）人: 北京科技大學
• 主分類號: B01L3/00
• 分類號: B01L3/00
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 皋吉甫

1.一種循環腫瘤細胞及團簇陰性分離的微流控裝置，其特征在于，所述微流控裝置由樣品存儲室和微流控芯片通過熱鍵合組裝而成，所述微流控芯片上設有多個微坑，所述微坑用于存儲和甄別定位單個腫瘤細胞或團簇，微流控裝置直徑小于等于細胞培養皿直徑，所述微流控裝置可放入培養皿中進行離心。

2.根據權利要求1所述的微流控裝置，其特征在于，所述微流控芯片設置在樣品存儲室內，所述微流控芯片用于對2-6mL全血進行陰性富集，并完成CTCs/CTC-Clusters的甄別、精確定位和后續分離純化。

3.根據權利要求2所述的微流控裝置，其特征在于，所述微流控芯片由1-64個微坑陣列形成，每個微坑陣列含有2000個微坑，微坑的大小同時適合物理性地捕獲單個腫瘤細胞或團簇，微坑之間呈等邊三角形排列，所述微流控芯片的微坑共計12-13萬個。

4.根據權利要求3所述的微流控裝置，其特征在于，所述微坑陣列以數字1~64分為64個大區；并對以字母A~P把每個大區分為16個小區，滿足在6.4X倍鏡下可以看到一個完整的以數字命名的區，達到對可疑信號的粗略定位；同時滿足在20X倍鏡下可看到一個完整的以字母命名的區，達到對可疑信號的精確定位。

5.根據權利要求1所述的微流控裝置，其特征在于，所述樣品存儲室由銅錢型圍堰構成，銅錢型圍堰的中間方孔為四棱臺。

6.根據權利要求1所述的微流控裝置，其特征在于，所述熱鍵合材料包括PDMS、玻璃、硅片和高分子聚合物，所述高分子聚合物為PS、PMMA、COC或PC，實驗室小試材料優選為PDMS，批量生產大試材料優選為高分子聚合物。

7.根據權利要求5所述的微流控裝置，其特征在于，所述樣品存儲室的容量能夠根據實驗需要調整圍堰的高和直徑，一次分析2-6ml血樣，所述樣品存儲室容量最大容量為18ML，所述樣品存儲室容量優選為10-15ml。

8.根據權利要求4所述的微流控裝置，其特征在于，所述微流控裝置通過低速離心后，每個微坑同時滿足對單個腫瘤細胞和腫瘤細胞團簇的高效物理捕獲，微坑直徑優選為50-100μm，深優選為40-60μm，間距優選為40-60μm。

9.一種循環腫瘤細胞及團簇陰性分離方法，所述方法用于外周血中，所述方法基于上述權利要求1-8之一所述的微流控裝置，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）微流控裝置表面處理：用10%山羊血清與3%牛血清白蛋白混合溶液注入溶液存儲室封閉1h以避免細胞的非特異性；

（2）陰性富集腫瘤細胞：首先，血液樣品稀釋后低速離心棄上層血清和血小板，待用；其次，將前一步處理的樣品密度梯度離心后，吸取中間的有核細胞層；再次，將前一步處理的樣品與CD45和CD15抗體標記的免疫磁珠共同孵育后，通過磁力架除去白細胞，得腫瘤細胞富集樣品；最后，將前一步處理的樣品與APC-CD45抗體和熒光葡萄糖類似物2-NBDG共同孵育，使白細胞和腫瘤細胞各標記上不同熒光；

（3）微流控芯片細胞捕獲：將通過陰性富集后的樣品，注入該裝置的樣品存儲室后，通過低速離心，樣品中的細胞可被底層的微坑捕獲；

（4）腫瘤細胞甄別及精確定位：用熒光顯微鏡6.4X倍鏡下統計每個陣列內2-NBDG+信號，20X倍鏡下確定2-NBDG+且APC-CD45- 信號的準確位置；

（5）分離純化：在明場下，找到甄別及精確定位后的微坑，用毛細針對循環腫瘤細胞或團簇進行個純化分離，挑選后，在明場和熒光場下進行再次確認。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，在步驟（2）中，依據腫瘤細胞的Warburg效應，利用熒光葡萄糖類似物2-NBDG熒光標記腫瘤細胞，使用2-NBDG得最佳濃度根據腫瘤細胞類型不同而不同，優選濃度為400-600μM，37℃孵育20min；

在步驟（3）中，低速離心，利用微坑進行物理性地捕獲細胞，離心速度優選為800-1000r/min，時間優選為5-3min。