[發(fā)明專利]一種用于制備手性苯基乙二醇的環(huán)氧化物水解酶的制備方法

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• 申請日: 2018-05-10
• 公開（公告）號: CN108588051A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金火喜;張千偉;徐紅萍
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12P7/22
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司 33101
• 代理人: 翁霽明

一種用于制備手性苯基乙二醇的環(huán)氧化物水解酶的制備方法，它是以來自微生物Agromyces mediolanus的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列為模板，在NCBI等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基于挖掘，將獲得的基因克隆到大腸桿菌、酵母或枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)；然后以苯基環(huán)氧乙烷為反應(yīng)底物，利用重組大腸桿菌靜息細(xì)胞進(jìn)行催化，檢測產(chǎn)物苯基乙二醇的對映體過量值，從而篩選獲得新型環(huán)氧化物水解酶，用于制備手性純的苯基乙二醇；具體是：將SEQ ID NO.1所示的環(huán)氧化物水解酶表達(dá)至大腸桿菌、酵母或枯草芽孢桿菌中，培養(yǎng)菌體細(xì)胞，以200～280U/g苯基環(huán)氧乙烷反應(yīng)底物的添加量加入所述細(xì)胞，并在pH為6～8的有機(jī)相中進(jìn)行催化，獲得手性純的苯基乙二醇。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種用于制備手性苯基乙二醇的環(huán)氧化物水解酶的制備方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

手性苯基乙二醇是一種重要用于合成手性精細(xì)化學(xué)品的中間體，可通過環(huán)氧化物水解酶立體選擇性水解苯基環(huán)氧乙烷來獲得。環(huán)氧化物水解酶是一類能夠立體選擇性催化環(huán)氧化物水解生成相應(yīng)鄰二醇的酶。因其廣泛存在于動植物及微生物中，且具有較高的立體選擇性而備受關(guān)注，已成為手性化學(xué)品、特別是手性藥物制備中重要的生物催化劑。大量從土壤中篩選獲得的野生菌株環(huán)氧化物水解酶拆分環(huán)氧化物時，酶活或立體選擇性都較低，難于滿足工業(yè)化應(yīng)用的要求。因此，尋找高效、高立體選擇性的酶源仍舊是研究者主要的工作目標(biāo)之一。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因組技術(shù)等的迅速發(fā)展，越來越多的酶基因組和基因序列得于公布，從大量的基因數(shù)據(jù)庫資源中尋找新的基因、挖掘其蘊(yùn)含的生物學(xué)功能已成為可能。因此，從基因組數(shù)據(jù)庫中挖掘和篩選已成為發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)良性能的新酶的重要手段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種以已報道的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列為模板，以苯基環(huán)氧乙烷為反應(yīng)底物，從基因數(shù)據(jù)庫中挖掘新型環(huán)氧化物水解酶，并用于制備手性苯基乙二醇的環(huán)氧化物水解酶的制備方法。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的，一種用于制備手性苯基乙二醇的環(huán)氧化物水解酶的制備方法，它是以來自微生物Agromyces mediolanus的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列為模板，在NCBI等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基于挖掘，將獲得的基因克隆到大腸桿菌、酵母或枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)；然后以苯基環(huán)氧乙烷為反應(yīng)底物，利用重組大腸桿菌靜息細(xì)胞進(jìn)行催化，檢測產(chǎn)物苯基乙二醇的對映體過量值，從而篩選獲得新型環(huán)氧化物水解酶，用于制備手性純的苯基乙二醇。

作為優(yōu)選：將SEQ ID NO .1所示的環(huán)氧化物水解酶表達(dá)至大腸桿菌、酵母或枯草芽孢桿菌中，培養(yǎng)菌體細(xì)胞，以200～280U/g苯基環(huán)氧乙烷反應(yīng)底物的添加量加入所述細(xì)胞，并在pH為6～8的有機(jī)相中進(jìn)行催化，獲得手性純的苯基乙二醇。

本發(fā)明以已報道的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列為模板，以苯基環(huán)氧乙烷為反應(yīng)底物，從基因數(shù)據(jù)庫中挖掘新型環(huán)氧化物水解酶，并用于制備手性苯基乙二醇。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)的介紹：本發(fā)明所述的一種用于制備手性苯基乙二醇的環(huán)氧化物水解酶的制備方法，它是以來自微生物Agromyces mediolanus的環(huán)氧化物水解酶氨基酸序列為模板，在NCBI等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基于挖掘，將獲得的基因克隆到大腸桿菌、酵母或枯草芽孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)；然后以苯基環(huán)氧乙烷為反應(yīng)底物，利用重組大腸桿菌靜息細(xì)胞進(jìn)行催化，檢測產(chǎn)物苯基乙二醇的對映體過量值，從而篩選獲得新型環(huán)氧化物水解酶，用于制備手性純的苯基乙二醇。

作為優(yōu)選的實(shí)施例：本發(fā)明將SEQ ID NO .1所示的環(huán)氧化物水解酶表達(dá)至大腸桿菌、酵母或枯草芽孢桿菌中，培養(yǎng)菌體細(xì)胞，以200～280U/g苯基環(huán)氧乙烷反應(yīng)底物的添加量加入所述細(xì)胞，并在pH為6～8的有機(jī)相中進(jìn)行催化，獲得手性純的苯基乙二醇。

本發(fā)明的其它實(shí)施例可以在上述公開的實(shí)施例基礎(chǔ)上，通過數(shù)值和特征的簡單替換，可以獲得無數(shù)個實(shí)施例，且本領(lǐng)域技術(shù)人員通過對本發(fā)明的了解以及結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)，能夠方便地實(shí)施本發(fā)明，且不需要做出任何創(chuàng)造性勞動。