[發(fā)明專利]東方巴貝斯蟲球狀體蛋白基因4及其編碼的蛋白

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810441715.9
• 申請日: 2018-05-10
• 公開（公告）號: CN108588096B
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賀蘭;趙俊龍;郭佳瑩;敖陽思琦;王森
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/44;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

本發(fā)明公開了一種東方巴貝斯蟲球狀體蛋白基因4，該基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了編碼所述東方巴貝斯蟲球狀體蛋白基因4的蛋白，該蛋白具有如序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。該蛋白可有效檢測水牛體內(nèi)東方巴貝斯蟲抗原的存在，具有良好的免疫原性，并應(yīng)用間接免疫熒光方法可檢測到蟲體存在，可作為診斷抗原的候選分子。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新的東方巴貝斯蟲基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

東方巴貝斯蟲是一種經(jīng)鐮形扇頭蜱傳播，只引起水牛巴貝斯蟲病的一種寄生原蟲。該蟲首次于1984年在中國的中部及南部首次發(fā)現(xiàn)，并于1997年正式命名為東方巴貝斯蟲。其引起的水牛巴貝斯蟲病主要發(fā)生在南方多地區(qū)，發(fā)病季節(jié)多在5、6月份，與鐮形扇頭蜱活動有關(guān)，具有顯著的地區(qū)性與季節(jié)性。發(fā)病水牛的臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、貧血、黃疸及血紅蛋白尿，嚴(yán)重者甚至死亡。如果診治不及時(shí)，死亡率較高，造成水牛養(yǎng)殖業(yè)巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前東方巴貝斯蟲的診斷方法主要為顯微鏡檢測、分子生物學(xué)檢測和血清學(xué)檢測。其中顯微鏡檢測需要檢測人員有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，且當(dāng)待檢樣品染蟲率低或混合感染時(shí)，容易出現(xiàn)誤判；分子生物學(xué)檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，但往往需要昂貴的儀器如PCR儀且操作煩雜，難以用于臨床檢測中；而東方巴貝斯蟲的血清學(xué)方法目前仍然處于實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段，臨床上鮮有應(yīng)用。

本申請人所在的農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的課題組通過大量篩選獲得球狀體蛋白基因4，通過生物信息學(xué)方法，對該基因進(jìn)行多方面分析發(fā)現(xiàn)該基因具有相對保守且良好的抗原性，具有深入研究作為候選診斷抗原的前景，接著從東方巴貝斯蟲中擴(kuò)增得到該基因，并進(jìn)行重組表達(dá)，經(jīng)免疫印跡和間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該基因表達(dá)的重組蛋白所產(chǎn)生的抗體特異性良好，靈敏度高，可作為東方巴貝斯蟲檢測的候選抗原分子。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是在東方巴貝斯蟲gDNA中擴(kuò)增得到球狀體蛋白基因4。

本發(fā)明的第二個目的是將所述東方巴貝斯蟲球狀體蛋白基因4(SBP4)在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，從而獲得重組蛋白。

本發(fā)明的第三個目的是提供上述重組蛋白在制備東方巴貝斯蟲病的檢測試劑盒中的應(yīng)用。

(1)本發(fā)明所述東方巴貝斯蟲球狀體蛋白基因4的獲得：利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法，以東方巴貝斯蟲gDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到東方巴貝斯蟲球狀體蛋白基因4，其核苷酸序列的開放閱讀框(ORF)如序列表SEQ ID NO：1所示。

(2)編碼了所述東方巴貝斯蟲球狀體蛋白基因4的截短重組蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

(3)所述重組蛋白，其制備方法為：將序列表SEQ ID NO：1所示的東方巴貝斯蟲球狀體蛋白基因4開放閱讀框(ORF)截短部分與大腸桿菌表達(dá)載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1-SBP4，利用感受態(tài)法轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，經(jīng)氨芐青霉素篩選高抗性的轉(zhuǎn)化子，并用1mmol/L IPTG于37℃誘導(dǎo)4h。收集上述IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，對其進(jìn)行分離純化，最終純化出的蛋白即為編碼了東方巴貝斯蟲球狀體蛋白基因4的重組蛋白。

(4)重組蛋白純化處理，按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)1000mL菌液，將誘導(dǎo)后的菌液于4℃條件下8000r/min離心15min集菌。取20mL PBS重懸菌體沉淀后，使用壓力破碎儀破碎3次；4℃，12000r/min離心10min，棄沉淀，收集上清，微濾后，用GST純化柱進(jìn)行純化，純化步驟同說明書。