[發明專利]一步法制備氨基膠體碳及其標記抗體的方法

有效

• 申請號: 201810430647.6
• 申請日: 2018-05-08
• 公開（公告）號: CN109142718B
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 張德軍;金偉;計夢琴;康靜茹;謝保泰
• 申請（專利權）人: 武漢納達康生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 徐瑛

本發明涉及一種單分散的氨基膠體碳的制備方法，以及相應的標記抗體的方法。一步法制備氨基膠體碳，步驟包括：將葡萄糖和乙酰葡萄糖溶于稀堿溶液中，于微波消解儀中反應，壓力1.0?1.5MPa，溫度為170?210℃，時間10?120min；將該產物離心并用水和乙醇洗滌三次，冷凍干燥得氨基膠體碳粉末。所得膠體碳粒徑為100?2000nm，分散性好（PDI0.1），且具有多種可修飾基團，如氨基、羧基、羥基等。利用膠體碳的氨基，使用環氧基分子作為偶聯臂，共價結合形成碳?抗體復合物，步驟包括：使用縮水甘油醚在堿性環境下活化氨基膠體碳，將偶聯臂接于膠體碳的氨基部位，再加入抗體，通過開環反應偶聯至連接分子的另一端；加入BSA封閉后，將產物離心，用BSA溶液洗滌兩次，再用復溶液復溶至初始體積，即得膠體碳?抗體復合物。該標記方法避免了膠體碳酸性或中性條件活化時易聚集的問題，通過共價鍵偶聯，復合物更穩定。

技術領域

本發明屬于碳納米材料制備和免疫檢測分析技術領域，涉及一步法制備氨基膠體碳，與之對應的抗體標記方法，以及在生物免疫檢測領域的潛在應用。

背景技術

免疫層析分析方法是藥殘、真菌毒素快檢領域常用的方法，具有操作簡便、快速定性或半定量、靈敏度較高等特點，對于大量樣本的現場初篩具有很大優勢，目前市面上主要是膠體金免疫層析產品。相比于膠體金，膠體碳有著獨特的優勢：原料來源廣泛、廉價，容易制備，成本更低，受pH值和鹽濃度等因素影響小，更穩定；抗體標記效率高；黑白色差大，信噪比高，靈敏度更高，檢測范圍更廣；生物兼容性好，無污染，更環保。自1993年VanAmerongen 等人將膠體碳作為一種新的標記物，用于免疫檢測以來，膠體碳在生物快檢領域得到了長足的發展，使之替代膠體金成為可能。

膠體碳的制備方法主要有水熱法、超聲法、模板法等，其中水熱法具有成本低、產量高，所得產物富含豐富的官能團等特點，微波水熱法進一步降低了反應時間，提高了反應時效，通常前驅體有葡萄糖、蔗糖、果糖等，可制得粒徑為100-2000nm的膠體碳。膠體碳的蛋白標記通常是靠電荷吸附，也可用膠體碳上的官能團偶聯，如一般采用EDC/NHS活化羧基再與蛋白的氨基偶聯，因此種偶聯方法在酸性環境下活化羧基最佳，而在酸性環境下，帶羧基的膠體碳容易聚集，所以活化效率不高。膠體碳在堿性條件下溶解性很好，因此，需要開發一種具有氨基官能團的膠體碳，以及在堿性環境下偶聯的方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供了一種新的膠體碳的制備方法，該膠體碳富含伯氨基，同時也含有大量的羥基、羧基、醛基等其它可修飾基團。

為實現以上目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

1、一種新的氨基膠體碳的制備方法，包括如下步驟，

1）將糖類和酰氨糖類按比例2-10:1溶于稀堿溶液中，于微波消解儀中反應，反應壓力為1.0-1.5MPa，溫度為170-210℃，時間10-120min。

2）將步驟1）所得產物離心，洗滌數次得沉淀。

3）將步驟2）所得沉淀冷凍干燥得固體粉末，即為氨基膠體碳。

優選的，步驟1）中糖類選擇葡萄糖，酰氨糖類選擇N-乙酰-D-氨基葡萄糖，優選比例為4:1。

優選的，步驟1）中稀堿溶液選擇5mM的NaOH溶液， 葡萄糖濃度為10%（w/v），乙酰氨基葡萄糖濃度2.5%（w/v）。

優選的，步驟1）微波消解儀設置為壓力主控1.2Mpa，溫度185℃，時間為20min，功率400W。

優選的，步驟2）離心力8000g 15min，洗滌溶液為水和乙醇，各洗滌三次。

優選的，步驟3）冷凍干燥時間為6-10小時。

優選的，步驟1）-3）所得膠體碳粒徑為200nm，PDI0.1。