[發明專利]一種以人復制缺陷腺病毒為載體的馬爾堡病毒病疫苗

有效

• 申請號: 201810428286.1
• 申請日: 2018-05-07
• 公開（公告）號: CN108715856B
• 公開（公告）日: 2019-08-20
• 發明（設計）人: 陳薇;吳詩坡;侯利華;聞雁波;張哲;王步森;宋小紅;張金龍;付玲
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12N15/861;C12N7/01;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 北京市眾天律師事務所 11478
• 代理人: 李新軍

本發明提供一種編碼馬爾堡病毒包膜糖蛋白的核苷酸序列，所述核酸序列如SEQ ID NO:1所示，本發明還公開了能夠表達該核苷酸序列的人復制缺陷重組腺病毒及其制備方法以及在制備預防馬爾堡病毒病疫苗中的應用。所述疫苗以E1、E3聯合缺失的復制缺陷型人5型腺病毒為載體，以整合腺病毒E1基因的HEK293細胞為包裝細胞系，攜帶的保護性抗原基因是密碼子優化后的馬爾堡病毒Angola株包膜糖蛋白基因。包膜糖蛋白基因經密碼子優化后，在轉染細胞中可檢測到包膜糖蛋白的顯著表達。該重組疫苗免疫動物后，能在短時間內誘導機體產生強烈的細胞及體液免疫反應，具有良好的免疫保護效果。該疫苗制備方法簡單，可在短期內大規模生產，用于應對突發馬爾堡病毒疫情和生物恐怖襲擊。

技術領域

本發明涉及一種核苷酸序列，更具體地，涉及一種病毒包膜糖蛋白的核苷酸編碼序列，屬于突變或遺傳工程技術領域。

背景技術

馬爾堡病毒(Marburg virus,MARV)屬于絲狀病毒科，是一種出血熱病毒。馬爾堡病毒可導致人類和非人靈長類動物產生病毒性出血熱——馬爾堡病毒病，病死率可高達90％。馬爾堡病毒是一種極度危險的病毒，WHO將其列為危險等級第4類病原體(需要生物安全等級4級實驗室進行相關操作)。美國NIH和國家過敏和傳染病研究所將其列為A類病原體，美國CDC將其列為A類生物恐怖戰劑。

馬爾堡病毒首次發現于1967年，當時在德國的馬爾堡、法蘭克福和南斯拉夫首都貝爾格萊德暴發小規模流行，共導致31人感染，其中7人死亡。起因是從烏干達進口的非洲綠猴攜帶了馬爾堡病毒，工作人員接觸了被馬爾堡病毒感染的猴組織而被感染。馬爾堡病毒因德國馬爾堡而得名。

馬爾堡病毒主要流行于撒哈拉以南的非洲地區，其宿主可能是果蝠。在人群中主要是經體液通過性交、破損皮膚接觸等方式傳播，非洲地區的葬禮儀式是病毒傳播的一大風險。馬爾堡病毒最大的兩次暴發分別為：1998年至2000年在剛果，共154人感染，128人死亡，病死率為83％；以及2004年至2005年在安哥拉，共252人感染，227人死亡，病死率為90％。

馬爾堡病毒株可分為Ravn病毒和馬爾堡病毒兩個分支。其中后者又可分為A毒株和B毒株兩種，A毒株分離自烏干達(1967年5株)、肯尼亞(1980)和安哥拉(2004-2005年)；B毒株分離自剛果共和國(1999-2000年)和烏干達(2007-2009年)。兩個分支毒株的基因同源性約為80％，而A、B兩毒株的基因同源性大于90％。

馬爾堡病毒包膜糖蛋白(Marburg virus glycoprotein,MARV-GP)是馬爾堡病毒包膜唯一的表面蛋白。MARV-GP在馬爾堡病毒的致病過程中起重要作用，同時，它也是誘導機體產生保護性免疫反應的主要靶蛋白。目前正在研制的馬爾堡病毒疫苗基本上都是以MARV-GP作為目標抗原，這些疫苗包括DNA疫苗、亞單位疫苗、非復制型和可復制型的病毒載體疫苗。有多種疫苗在動物模型上獲得良好的免疫保護效果，一些疫苗已經進入到了臨床試驗階段，包括DNA疫苗，改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified vaccinia virus Ankara,MVA)載體埃博拉-馬爾堡聯合疫苗和黑猩猩3型腺病毒(cAd3)載體馬爾堡疫苗。然而，截止到2018年4月，目前世界上還沒有批準的馬爾堡病毒疫苗。

AdMax系統由含有LoxP位點的穿梭質粒、骨架質粒和HEK293細胞株組成，外源基因序列被構建入穿梭質粒后，通過與骨架質粒在HEK293細胞中進行基因重組產生重組腺病毒。經AdMax系統包裝所獲得的重組腺病毒是E1和E3區缺失的復制缺陷型腺病毒，以此作為疫苗，具有安全性高的優點。此外，AdMax系統還具有包裝高效穩定、方便快捷，出毒快、產率高等優點。此前本申請發明人使用AdMax系統成功制備了以Zaire型埃博拉病毒Makona株包膜糖蛋白為目標抗原的重組埃博拉病毒病疫苗，實現了5個月內完成從基因合成到疫苗進入臨床研究的快速研制實例，突顯了該疫苗包裝系統的優勢。