[發明專利]中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白核酸適配子A42及其篩選方法和應用

有效

• 申請號: 201810426293.8
• 申請日: 2018-05-07
• 公開（公告）號: CN108753787B
• 公開（公告）日: 2020-06-26
• 發明（設計）人: 蘭小鵬;洪笑遷;劉寬燦;王開宇;謝富安;楊坤榮;黃素紅
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍南京軍區福州總醫院
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;C07K14/47;G01N33/68
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 張磊

本發明涉及一種中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白核酸適配子A42及其篩選方法和應用，所述適配子A42的序列為：5’?AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCGTGCGGATGTACAGGGACTTGGATAGTTTCTGA CCTATGCGTGCTACCGTGAA?3’；該核酸適配子A42能高親和力、高特異性地與NGAL結合，其中Kd值為66.55nM，其在AKI診斷方面具有應用前景，可運用于分離、純化中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白中、制備中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白的檢測試劑中以及研制治療中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白相關疾病藥物中。

技術領域

本發明涉及一種中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白核酸適配子A42及其篩選方法和應用。

背景技術

急性腎損傷(Acute Kidney Injury，AKI)是一種腎小球濾過率急劇下降所導致的臨床常見疾病，臨床表現包括血清尿素氮和血清肌酐水平突然并持續升高，同時伴有鹽水失衡。AKI是各種嚴峻條件下的一種最為常見的綜合癥，住院患者中的發病率為5％-7％，而危重患者中高達30％，并且患有AKI的危重患者的死亡率高達50％。此外，AKI與不良轉歸密切相關，包括死亡率增加、住院時間延長、危重患者的機械通氣持續時間延長，及發展為慢性腎臟疾病風險增加等。

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(Neutrophil gelatinase associatedlipocalin，NGAL)，又名脂質運載蛋白2、噬鐵蛋白或癌基因24p3，分子量25kD，在體內以多種形式存在，單體、46kD的同源二聚體、與金屬蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase 9，MMP-9)結合形成的135kD的異源二聚體。NGAL在各種損傷后合成增加，尤其是腎臟疾病，被認為是最有前景的腎臟內科臨床標志物。研究表明NGAL與AKI密切相關，在AKI患者的血清和尿液中NGAL水平顯著升高，并且升高程度與腎臟損傷嚴重程度相關，因此NGAL是早期診斷AKI 的強有力的指標，在各類疾病誘發的AKI的早期診斷、預測及治療后腎功能恢復情況的監測中有著明顯的優勢和臨床價值，具有巨大的應用前景，運用好 NGAL檢測，將大大降低AKI發病率和死亡率。

核酸適配子是一類具有特殊的三維立體結構(發卡，假結，凸環，G-四聚體等)，可以高特異性高親和性結合靶標的單鏈DNA(Single stranded DNA， ssDNA)或RNA。核酸適配子通過指數富集的配體系統進化技術(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，SELEX)篩選獲得，核酸適配子具有穩定性好、生產周期短、費用低、可化學合成大量生產、進行各種功能化修飾等優點，因此，核酸適配子在檢測診斷方面具有廣闊的前景。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高親和力、高特異性的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白核酸適配子A42及其篩選方法和應用。

本發明的目的通過如下技術方案實現：一種中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白核酸適配子A42，它的序列如下所示：

AGCAGCACAGAGGTCAGATGCCGTGCGGATGTACAGGGAC 40

TTGGATAGTTTCTGACCTATGCGTGCTACCGTGAA 75；

在25℃，0.1M Na⁺，0.001M Mg²⁺條件下其二級結構為莖環結構，其分子結構如下：

所述的中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白核酸適配子A42的篩選方法，基于核酸適配子的體外SELEX篩選技術，利用羧基磁珠作為固相介質，以NGAL為靶標，通過NGAL羧基磁珠從ssDNA庫中篩選得到與NGAL特異性結合的核酸適配子。