[發明專利]一種基于單鏈DNA構建R-loop高通量測序文庫的方法

在審

• 申請號: 201810423697.1
• 申請日: 2018-05-06
• 公開（公告）號: CN108588176A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發明（設計）人: 唐瓊;沈歡;陸利;秦闖華;鞠魏;唐薇;朱虎;徐根明;潘藝;趙謙
• 申請（專利權）人: 湖南大地同年生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于單鏈DNA構建R-loop高通量測序文庫的方法，其特征在于按照以下步驟進行：

(1)進行基因組DNA片段化處理及純化；

(2)在步驟(1)后直接加入復合物[S9.6]/Protein A，實現DNA/RNA雜合鏈的捕獲；

(3)在步驟(2)后直接加入酶和緩沖液組分，實現末端修飾；

(4)在步驟(3)后直接進行變性，變性條件為95℃下10min，變性后立即置冰上；

(5)在步驟(4)后直接加入3'接頭、酶和緩沖液，實現3'接頭連接；

(6)在步驟(5)后直接加入5'接頭、酶和緩沖液，實現5'接頭連接；

(7)在步驟(6)后直接加入擴增體系，進行文庫的放大；

(8)在步驟(7)后直接加入磁珠對擴增后的文庫進行純化，純化后的產物即為上機文庫。

2.根據權利要求1所述的一種基于單鏈DNA構建R-loop高通量測序文庫的方法，其特征在于所述的片段化方式包括物理法，如超聲和酶法，基因組DNA片段化成200-500bp，片段化的DNA加入磁珠進行純化。

3.根據權利要求1所述的一種基于單鏈DNA構建R-loop高通量測序文庫的方法，其特征在于所述的DNA來源包括人類的全血、新鮮組織、石蠟包埋組織(FFPE)、口腔脫落細胞、細胞系、糞便、尿液、外泌體以及其它體液，同時可用于其它動物物種、植物、細菌以及病毒。

4.根據權利要求1所述的一種基于單鏈DNA構建R-loop高通量測序文庫的方法，其特征在于所述的緩沖液包括：5～500mM Tris-HCl(pH7.0～9.0)、5～500mM NaCl、1～100mMEDTA。

5.根據權利要求1所述的一種基于單鏈DNA構建R-loop高通量測序文庫的方法，其特征在于所述的步驟(5)中的3'接頭包含連接引物和固定引物，連接引物為測序引物，連接引物堿基需修飾，所述的堿基修飾包括甲基化修飾、氨基化修飾、磷酸化修飾、硫代修飾、C3Spacer修飾；固定引物5'端為測序引物序列，3'端為序列特異性引物序列，固定引物序列堿基需修飾，修飾包括甲基化修飾、氨基化修飾、磷酸化修飾、硫代修飾、C3 Spacer修飾，所述的序列特異性引物序列包括基因特異性引物、隨機引物，如NNNNNN，N＝A或C或G或T，多聚物寡核酸，如oligo dT，其中基因特異性引物長度為15-60bp，隨機引物長度為3-20bp，多聚物寡核酸長度為10-60bp。

6.根據權利要求1所述的一種基于單鏈DNA構建R-loop高通量測序文庫的方法，其特征在于所述的步驟(6)中的5'接頭包含連接引物和固定引物，連接引物為測序引物，固定引物5'端為測序引物序列，3'端為序列特異性引物序列，序列特異性引物序列包括基因特異性引物、隨機引物，如NNNNNN，N＝A或C或G或T，多聚物寡核酸，如oligod，基因特異性引物長度為15-60bp，隨機引物長度為3-20bp，多聚物寡核酸長度為10-60bp，固定引物序列堿基需修飾，修飾包括甲基化修飾、氨基化修飾、磷酸化修飾、硫代修飾、C3 Spacer修飾。

7.根據權利要求1所述的一種基于單鏈DNA構建R-loop高通量測序文庫的方法，其特征在于所述的上機文庫適用于Roche、Illumina、ThermoFisher、Pacific Biosciences、華大基因、Oxford Nanopore Technologies、華因康、瀚海基因高通量測序平臺。