[發明專利]LsH3在黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染下瓠瓜分析中作為內參基因的用途

有效

• 申請號: 201810422078.0
• 申請日: 2018-05-04
• 公開（公告）號: CN110438250B
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 鄭紅英;燕飛;張趁華;吳昕揚;彭杰軍;魯宇文;林林;陳劍平
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

1.LsH3在黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染下瓠瓜葉片或果實qRT-PCR分析中作為內參基因的用途，其特征在于：所述的內參基因LsH3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一種黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染下瓠瓜葉片或果實qRT-PCR分析LsIPT或LsDdRP的方法，其特征在于，它包括如下步驟：

步驟1：供試樣品處理

瓠瓜幼苗種植于溫室土壤中，保持溫度20-25℃，每3天澆一次水，在兩葉一心期將黃瓜綠斑駁花葉病毒病汁液摩擦接種于展開的系統葉片；病汁液是通過將100mg黃瓜綠斑駁花葉病毒感病組織勻漿于20倍體積的PBS緩沖液中所形成；健康植株用PBS緩沖液處理作為對照；

隨機選取黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染的瓠瓜系統葉片、果實和健康瓠瓜系統葉片、果實于液氮中保存備用；

步驟2：RNA的提取和cDNA的合成

將液氮中保存備用的供試樣品進行RNA提取，每個處理設置3次生物學重復；用變性凝膠電泳和生物分析儀檢測RNA質量和濃度；對上述每個RNA進行反轉錄得到對應的cDNA；

步驟3：提供參考基因LsIPT或LsDdRP的引物，其中，

LsIPT引物的核苷酸序列如下：

正向引物序列：GCACTCCAATGGCTCGTTTA；

反向引物序列：GGTCGATGGTGGATTTGTCG；

LsDdRP引物的核苷酸序列如下：

正向引物序列：AAACTCCCTTTCAGCCTCGA，

反向引物序列：AGATGTGGCCCTGTTGAGAA；

提供內參基因LsH3的引物，所述LsH3引物的核苷酸序列如下：

正向引物序列：CAAACTGCCCGTAAGTCCAC；

反向引物序列：GGCTTCTTCACTCCTCCTGT；

步驟4：qRT-PCT分析

將已合成的cDNA溶液稀釋5倍作為qRT-PCR的初始濃度；10μL qRT-PCR反應體系包含：5μL的2×SYBR Premix Ex Taq溶液，0.5μL的cDNA溶液，參考基因LsIPT或LsDdRP以及內參基因LsH3的正向、反向引物各0.15μL，3.9μL的RNase Free dH₂O；

反應程序為：95℃預變性5min；95℃變性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸15sec，40個循環；每個樣品設置3次重復。