[發明專利]一種PLS3-ABD2重組蛋白的制備方法

在審

• 申請號: 201810421603.7
• 申請日: 2018-05-04
• 公開（公告）號: CN108611368A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 史方浩;馬艷;張衛凱;范林洋;胡志遠
• 申請（專利權）人: 國家納米科學中心
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/62;C07K14/47;C07K1/22;C07K1/16;C40B30/04
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;王璐

本發明屬于生物技術領域，具體公開了一種PLS3?ABD2重組蛋白的制備方法。本發明將含有SEQ ID NO.4所示序列的DNA分子克隆至真核表達載體，并將所述真核表達載體轉染至真核宿主細胞系中進行培養，使得采用該方法制備得到的PLS3?ABD2重組蛋白，相比現有技術(原核表達)而言，由真核細胞翻譯后再加工修飾產生的外源蛋白質，在活性方面遠勝于原核表達系統，更接近于天然蛋白質，可為后續用于與PLS3蛋白相互作用的蛋白篩選以及與PLS3蛋白特異性結合的多肽篩選奠定基礎。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及PLS3-ABD2重組蛋白的制備。

背景技術

肌動蛋白成束蛋白PLS3是Plastin蛋白家族中的一員，又被稱為T-plastin，基因定位于Xq23，mRNA蛋白質編碼區(Coding sequence,CDS)包括1893個核苷酸，蛋白由630個氨基酸組成。它可以與α、β、γ三種肌動蛋白結合，并在多種實體組織細胞中表達，在外周血中不表達。PLS3在腫瘤發生和發展過程中扮演著重要角色。研究表明，PLS3能調控調控細胞運動、腫瘤細胞的存活和遷移，并能調控腫瘤細胞對順鉑等化療藥物或UV的敏感性。除此之外，PLS3可能是一種潛在的腫瘤標志物：它的異常表達可以作為皮膚T細胞淋巴瘤的標志物；結直腸癌循環腫瘤細胞(Circulating tumor cells,CTCs)中PLS3的表達與結直腸癌患者的遠端轉移和預后相關。綜上所述，PLS3與腫瘤的發生發展密切相關，而明確PLS3在腫瘤發生發展中的功能，對腫瘤的診斷、治療及預后均具有非常重要的意義。

盡管PLS3有非常重要的作用，但PLS3蛋白的制備方法仍然存在問題。PLS3蛋白由EF-2hands和4個CH(Calponin-homology)結構域組成，其中CH3和CH4為主要的功能結構域，二者稱為ABD2(Actin-binding domain 2)。商品化的PLS3蛋白大多是ABD2的重組蛋白，該結構域存在多個保守位點，是PLS3抗體的主要靶向結構域。商品化的PLS3蛋白多為原核表達系統所表達的，缺乏真核系統蛋白合成過程的天然修飾。原核表達系統所表達的重組蛋白可能在空間構象等方面與真核系統表達的PLS3蛋白存在差異，為后續用于與PLS3蛋白相互作用的蛋白篩選以及與PLS3蛋白特異性結合的多肽篩選帶來困難。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種PLS3-ABD2重組蛋白的制備方法，使得采用該方法制備得到的PLS3-ABD2重組蛋白，相比現有技術(原核表達)而言，由真核細胞可以形成穩定的二硫鍵，在蛋白翻譯后進行正確的修飾，所產生的外源蛋白質更具有天然活性而不是被降解或者形成包涵體，在活性方面遠勝于原核表達系統，更接近于天然蛋白質，可為后續用于與PLS3蛋白相互作用的蛋白篩選以及與PLS3蛋白特異性結合的多肽篩選奠定基礎。

目前商品化的PLS3蛋白多為原核表達系統所表達的，缺乏真核系統蛋白合成過程的二硫鍵和糖基化修飾，空間結構上與天然PLS3蛋白存在較大差異。而在進行與PLS3蛋白相互作用的蛋白篩選以及與PLS3蛋白特異性結合的多肽篩選過程中，一些保守位點由于天然PLS3蛋白的空間結構的存在而被折疊在蛋白內部，所以很難篩選到與這些位點結合的蛋白或者多肽。但由原核表達系統所得到的蛋白，由于缺少復雜的糖基化修飾，部分結合位點被錯誤的暴露出來，對相互作用的蛋白篩選和特異性結合的多肽篩選造成了困擾。而本發明所提供的方法，能夠高效表達PLS3-ABD2蛋白以外，能夠對表達的蛋白進行正確折疊，并進行復雜的糖基化修飾，蛋白活性接近于天然蛋白，因此在用于與PLS3蛋白相互作用的蛋白篩選以及與PLS3蛋白特異性結合的多肽篩選具有一定優勢。

為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：

本發明提供一種PLS3-ABD2重組蛋白的制備方法，所述方法包括：將含有SEQ IDNO.4所示序列的DNA分子克隆至真核表達載體，并將所述真核表達載體轉染至真核宿主細胞系中進行培養。