[發明專利]一種利用HPLC測定藍花丹中白花丹素含量的方法

在審

• 申請號: 201810415957.0
• 申請日: 2018-05-03
• 公開（公告）號: CN108645927A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 高素萍;胡菊;朱原;吳一超;陳曦;胡荻
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 成都帝鵬知識產權代理事務所(普通合伙) 51265
• 代理人: 黎照西

1.一種利用HPLC測定藍花丹中白花丹素含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)樣品采集、烘干及粉碎：

采集藍花丹植株的組織樣品材料，進行烘干后制成樣品粉末；

(2)標準品儲備液的制備及標準曲線的繪制：

稱取標準品白花丹素5.1mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后得到標準品儲備液A；吸取標準品儲備液A2.0mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后得到標準品儲備液B；吸取標準品儲備液B 1.0mL，置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后得到標準品儲備液C；

依次取標準品儲備液A 1μL、5μL、15μL、20μL、40μL，標準品儲備液B 1μL、5μL、10μL，標準品儲備液C 1μL、5μL、15μL，分別注入高效液相色譜儀中，以進樣量為橫坐標，測得的峰面積為縱坐標，用峰面積的平均值建立校準曲線的相關系數，繪制標準曲線，得到白花丹素的線性回歸方程；

(3)樣品液的制備及樣品液中白花丹素含量測定：

取步驟(1)所得藍花丹樣品粉末0.5g，用25mL甲醇溶解，超聲波處理30min，過0.22μm濾頭后注入高效液相色譜儀中進行測定，根據線性回歸方程計算樣品液中白花丹素的含量；

高效液相色譜儀采用的色譜條件包含如下：流動相：A液為0.1％(V:V)的H₃PO₄-水溶液，B液為甲醇；梯度洗脫程序：0min、0:40(V_A:V_B)；21min、25:75(V_A:V_B)；23min、10:90(V_A:V_B)；30min、10:90(V_A:V_B)。

2.根據權利要求1所述的利用HPLC測定藍花丹中白花丹素含量的方法，其特征在于，色譜條件中的流速為1mL/min，進樣量為20μL。

3.根據權利要求1所述的利用HPLC測定藍花丹中白花丹素含量的方法，其特征在于，所述高效液相色譜儀的檢測波長為254nm，檢測時間為21min，檢測的注溫為40℃。

4.根據權利要求1所述的利用HPLC測定藍花丹中白花丹素含量的方法，其特征在于，所述高效液相色譜儀采用的色譜柱為：Agilent Technologies 1260 Infinity II液相色譜系統，色譜柱規格為：4.6×250mm，5μm，檢測靈敏度為0.16AUFS。

5.根據權利要求1所述的利用HPLC測定藍花丹中白花丹素含量的方法，其特征在于，所述流動相使用前先過0.22μm濾膜進行真空過濾。

6.根據權利要求1所述的利用HPLC測定藍花丹中白花丹素含量的方法，其特征在于，所述藍花丹植株的組織樣品材料包括來源于組培的無菌材料和實生材料的藍花丹根、莖、葉及全株植株。

7.根據權利要求6所述的利用HPLC測定藍花丹中白花丹素含量的方法，其特征在于，所述組培的無菌材料從組培瓶中取出后，輕輕沖洗掉培養基，放在濾紙上吸干多余水分，按照根、莖、葉及全株植株進行分裝標記。

8.根據權利要求6所述的利用HPLC測定藍花丹中白花丹素含量的方法，其特征在于，所述的實生材料從土里整株拔出，用流水徹底清洗掉根部泥土、污垢及雜質，去掉枯枝敗葉，放在濾紙上吸干多余水分，按照根、莖、葉及全株植株進行分裝標記。

9.根據權利要求7或8所述的利用HPLC測定藍花丹中白花丹素含量的方法，其特征在于，將分裝好的植物組織材料在陰涼環境下干燥，然后置于65℃恒溫烘箱中烘24～48h至恒重，記錄其干重，然后用粉碎機粉碎。

10.根據權利要求1所述的利用HPLC測定藍花丹中白花丹素含量的方法，其特征在于，步驟(2)中所述甲醇的純度均為AR級，步驟(3)中所述甲醇的純度均為HPLC級。