[發(fā)明專利]核酸提取方法在審
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201810404724.0 | 申請(qǐng)日： | 2018-04-28 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN108410859A | 公開（公告）日： | 2018-08-17 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 楊尚鑫;胡彬;劉杰;蔡媛媛;陶施芳 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 紹興迅敏康生物科技有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C12N15/10 | 分類號(hào)： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 杭州天昊專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33283 | 代理人： | 向慶寧;黃芳 |
| 地址： | 312071 浙江省紹興市*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 核酸提取 裂解 核酸 前處理液 前處理 步驟簡化 磁珠吸附 熱裂解 磁珠 熱裂 吸附 成功率 耗時(shí) | ||
本發(fā)明公開了一種核酸提取方法，包括裂解步驟和轉(zhuǎn)移步驟，裂解步驟完成核酸的熱裂解和磁珠吸附熱裂解釋放的核酸，裂解步驟在裂解區(qū)域完成；將吸附有核酸的磁珠轉(zhuǎn)移到前處理液中、完成轉(zhuǎn)移步驟；前處理液位于前處理區(qū)域，裂解區(qū)域與前處理區(qū)域相互獨(dú)立。本發(fā)明提供了一種核酸提取步驟簡化、提取耗時(shí)短、提高核酸提取成功率且核酸提取量損失少的核酸提取方法。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及核酸提取領(lǐng)域，更具體的說，它涉及核酸提取方法。
背景技術(shù)
核酸，例如DNA或者RNA，的提取目前主要采用離心柱法和磁珠法兩種提取方法。傳統(tǒng)的離心柱技術(shù)也應(yīng)用膜進(jìn)行核酸純化，它的膜的原理屬于硅吸附方法，這種膜只對(duì)核酸有較強(qiáng)的親和力和吸附力。操作時(shí)首先應(yīng)用蛋白酶在56℃溫度條件下對(duì)樣本進(jìn)行裂解，然后將裂解液加入柱子中離心，核酸被吸附于膜上，而其他雜質(zhì)被甩出，最后用洗脫液將核酸洗脫下來。此方法提取效果好，但是裂解時(shí)需要加熱，核酸純化時(shí)需要多次離心，整個(gè)提取過程耗時(shí)2個(gè)小時(shí)左右，其成本高、操作復(fù)雜、耗時(shí)長、依賴實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，并難以提取易降解的RNA。
磁珠法核酸提取是以納米生物磁珠為載體的一種新型核酸提取技術(shù)，核酸分子可與磁珠表面的硅羥基發(fā)生特異性識(shí)別與結(jié)合，在外部磁場的作用下發(fā)生聚集或分散，從而進(jìn)行核酸分離純化。目前，對(duì)于DNA的提取，磁珠法核酸提取一般包括裂解、結(jié)合、洗滌、洗脫四個(gè)主要步驟，每一步驟又可由多種不同的方法單獨(dú)或聯(lián)合實(shí)現(xiàn)。如果對(duì)于RNA的提取，相比DNA的提取，更為復(fù)雜，目前任然采用過柱的方法進(jìn)行提取和純化，同時(shí)需要加入防治RNA降解的諸多酶，傳統(tǒng)的RNA的提取方法耗時(shí)長，所用的材料多，總體成本高。
磁珠法核酸提取儀器可分為：移液式和磁棒式。移液式核酸提取是通過轉(zhuǎn)移反應(yīng)溶液來實(shí)現(xiàn)核酸的提取純化，其步驟包括：向樣本加入裂解液，吹打混勻，反復(fù)磁珠吸附、移走裂解液、加入洗滌液洗滌磁珠、對(duì)磁珠吸附、移走洗滌液、加入洗脫緩沖液等操作，從而得到純化的核酸。然而移液式儀器有一個(gè)致命的缺陷，為了盡可能徹底地除廢液，移液吸頭需要伸入到深孔板底部，如果吸頭靠磁珠太近，會(huì)使得磁珠和廢液一起吸掉，從而導(dǎo)致每次這樣吸取廢液時(shí)會(huì)有小部分殘液留在管底部，從而影響后續(xù)的洗脫效率和核酸的擴(kuò)增，例如PCR擴(kuò)增反應(yīng)的成功率。
磁棒式核酸提取儀器采用磁棒法的磁性分離方式，通過特制的磁棒套進(jìn)行轉(zhuǎn)移磁珠同時(shí)轉(zhuǎn)移樣本，磁珠定向團(tuán)聚在磁棒表面的專門的磁棒套上，通過精確的運(yùn)動(dòng)來實(shí)現(xiàn)磁珠從樣本裂解液到洗滌液在到洗脫液，從而完成核酸測(cè)自動(dòng)化提取過程。具體操過程如下：
步驟1、加樣本：撕開封膜，加入液體樣本到裂解液孔中；
步驟2、裂解/結(jié)合：裂解液裂解樣本(反應(yīng)一段時(shí)間，期間底部會(huì)加熱加速裂解)，期間磁棒套(只有磁棒套、無磁棒)插入到液面下進(jìn)行上下振蕩混勻，使核酸懸浮在裂解液中；裂解完成后，帶磁棒的磁棒套伸入磁珠孔將磁珠吸起，轉(zhuǎn)移到裂解液孔中，磁棒取出，磁棒套上下振蕩混勻使得磁珠均勻分散到裂解液中吸附核酸，靜置一段時(shí)間后，磁棒插入然后靜置或上下振蕩至磁珠都吸附在磁棒套上；
步驟3、鹽洗：將從裂解液中吸附磁珠轉(zhuǎn)移到鹽洗的孔中，磁棒取出，磁棒套上下振蕩混勻使得磁珠均勻分散到鹽洗液中，靜置一段時(shí)間后，磁棒插入然后靜置或上下振蕩至磁珠都吸附在磁棒套上；
步驟4、洗滌：將鹽洗后的磁珠取出，轉(zhuǎn)移到洗滌液中，磁棒套上下振蕩混勻使得磁珠均勻分散到洗滌液中，靜置一段時(shí)間后，磁棒插入然后靜置或上下振蕩至磁珠都吸附在磁棒套上；
步驟5、洗脫：將洗滌后的磁珠取出，磁棒取出，磁棒套上下振蕩混勻使得磁珠均勻分散到洗脫液中，一般加熱至65℃/5min靜置、加熱使核酸與磁珠脫離，在較高的溫度下、磁棒插入然后靜置或上下振蕩至磁珠都吸附在磁棒套上，回收磁珠，如此，核酸提取儀的工作完成。
之后，將反應(yīng)板從一起中取出，手工用移液器將含有核酸的洗脫液轉(zhuǎn)移。
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