[發明專利]溶膠凝膠法固定β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶雙酶的方法

有效

• 申請號: 201810400695.0
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108660129B
• 公開（公告）日: 2021-11-30
• 發明（設計）人: 金征宇;龍杰;潘婷;徐學明;謝正軍;周星;柏玉香;焦愛權;田耀旗;趙建偉;王金鵬
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N11/089
• 分類號: C12N11/089;C12N9/04;C12N9/26
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

本申請提供了一種固定β?呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶雙酶的方法，包括如下步驟：(1)β?呋喃果糖苷酶的生產；(2)β?呋喃果糖苷酶的分離純化；(3)純化后的β?呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶溶液在硅烷偶聯劑的存在下通過溶膠凝膠法固定在凝膠上。與傳統的固定化β?呋喃果糖苷酶生產低聚乳果糖相比較，本發明首次采用溶膠凝膠法固定β?呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶雙酶以提高酶的穩定性，得到較高的酶活回收率，提高低聚乳果糖得率，與傳統方法相比操作簡單，條件溫和，為一種環境友好型的綠色方法。

技術領域

本發明涉及酶工程技術領域，尤其是涉及一種β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶通過溶膠凝膠法實現雙酶共固定化生產低聚乳果糖的新方法。

背景技術

β-呋喃果糖苷酶(EC 3.2.1.26)是一種廣泛存在于植物和微生物中的糖苷酶，既具有水解作用，能催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖，又具有轉糖基作用，可廣泛用于合成功能性低聚糖、食品添加劑、糖苷類物質的修飾與改性和其它的生物活性物質。但是不同來源的β-呋喃果糖苷酶性質不同，轉糖基的能力和受體特異性也不同，節桿菌產β-呋喃果糖苷酶主要用于催化合成低聚乳果糖，能以蔗糖和乳糖為原料，將蔗糖水解產生的果糖基轉移至乳糖還原性末端的C₁位羥基上，生成半乳糖基蔗糖即低聚乳果糖。

而由于β-呋喃果糖苷酶來源于微生物發酵，酶制劑存在大量雜質、酶的催化活性低、穩定性差、酶的利用率低，反應之后游離酶不易與產物分離，反應產物純化成本高，難以實現工業化大生產。并且在合成低聚乳果糖的過程中，β-呋喃果糖苷酶也能催化蔗糖和低聚乳果糖水解產生副產物葡萄糖，葡萄糖會非競爭性抑制果糖苷酶轉果糖基活性，使低聚乳果糖得率降低，而葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖轉化為葡萄糖酸，消除底物抑制，提高低聚乳果糖轉化率。

酶的固定化是人們針對游離酶的缺點發展起來的新技術。與游離的酶相比，固定化酶具有很多優點，酶在固定化過程中可能發生一些結構變化，從而在一定程度上改變其性質和活性。而另一方面，通過合適的方法固定酶可使得酶結構剛性化在一定程度上能防止酶變性，并最終提高穩定性和活性等性能，實現酶的重復利用，并且固定化酶還能實現酶與產物的分離，降低產物分離純化成本。

由于低聚糖的快速發展，β-呋喃果糖苷酶的固定化逐漸成為研究的熱點，但由于酶本身穩定性差，不易包埋等特點，關于果糖苷酶固定的文獻并不多，研究最為廣泛的是殼聚糖和海藻酸鈉包埋法，但是這些材料機械強度不高，固定化酶活性保留率都不高，基本在60％左右，并且酶在多次使用后活性下降明顯。

溶膠凝膠法是將一定量的硅酯、水、催化劑和溶劑等物質混合，振搖，通過水解、縮合(包括聚縮合)、溶膠、老化、凝膠而固化的方法。溶膠凝膠法以其溫和的反應條件、廣泛的適用性以及較高的生物分子結構和酶活保留率等突出優點成為固定化酶的有效方法。由于二氧化硅比有機聚合物材料更具有化學和熱穩定性，所以應用得較為廣泛。但是普通的溶膠凝膠法對于β-呋喃果糖苷酶的固定會使得包埋在凝膠里的酶的活性釋放受到抑制，表現出的酶活明顯降低，更加無法與β-呋喃果糖苷酶同時固定其他酶，使得其應用受到了一定限制。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本申請人提供了一種β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶通過溶膠凝膠法實現雙酶共固定化生產低聚乳果糖的方法。與傳統的固定化β-呋喃果糖苷酶生產低聚乳果糖相比較，本發明首次采用溶膠凝膠法固定β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶雙酶以提高酶的穩定性，得到較高的酶活回收率，提高低聚乳果糖得率，與傳統方法相比操作簡單，條件溫和，為一種環境友好型的綠色方法。

本發明的技術方案如下：

一種固定β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶雙酶的方法，包括如下步驟：

(1)β-呋喃果糖苷酶的生產；

(2)β-呋喃果糖苷酶的分離純化；

(3)純化后的β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶溶液在硅烷偶聯劑的存在下通過溶膠凝膠法固定在凝膠上。