[發明專利]基于細胞分裂ftsZ基因表達量的藍藻快速生長期判別方法

有效

• 申請號: 201810400286.0
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108660190B
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 史小麗;陽振;于洋;張民;陳開寧
• 申請（專利權）人: 中國科學院南京地理與湖泊研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/04;G16B20/00;G06F17/18;C12R1/89
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓;尹妍

1.一種基于細胞分裂ftsZ基因表達量的藍藻快速生長期判別方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）在春初至夏初，在湖泊不同采樣點采集完整水柱的藻樣，提取各樣品RNA，并對RNA進行反轉錄得到微囊藻cDNA；

（2）利用ftsZ基因和微囊藻16Sr RNA序列的引物擴增步驟（1）得到的微囊藻cDNA；微囊藻cDNA擴增的PCR反應體系為：2mmol/ L dNTP mix 5 μL，25 mmol/L Mg²⁺ 2μL，10μmol/L上、下游引物各1.5 μL，1U/μL高保真DNA聚合酶1μL，10×PCR buffer 5μL，cDNA 3μL，去離子水補足至50μL；

其中ftsZ基因引物如下：

ftsZF2 GCTGAAGAATCGCGGGAAGA；ftsZR4 ATCCAGCATCGGCCATGAT；

微囊藻16Sr RNA序列的引物序列如下：

184F GCCGCRAGGTGAAAMCTAA；431R AATCCAAARACCTTCCTCCC；

（3）用熒光定量PCR擴增每個樣品的ftsZ和16Sr RNA基因，以16Sr RNA為管家基因，ftsZ為目的基因，推算單位細胞中ftsZ基因的相對表達量；

（4）利用采集的完整水柱的藻樣分離出的微囊藻，通過室內培養實驗，建立微囊藻生長率μ和ftsZ基因相對表達量的回歸方程，確定微囊藻的快速生長期，得到此時ftsZ基因相對表達量，作為藍藻快速生長期窗口的閾值，大于該閾值判定為湖泊藍藻快速生長期；

將分離取自湖泊的微囊藻群體分若干處理組在不同生長環境中培養，每天取樣測量藻細胞的密度變化，獲得藻細胞不同生長環境下各生長周期的生長率；生長率計算公式為：μ=（lnN_t- lnN₀）/t，其中，N_t和N₀分別代表t時刻和初始時刻的細胞密度；培養周期30天，每3天對各處理組的微囊藻進行取樣，得到單位細胞中ftsZ基因的相對表達量。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1）中，在湖泊不同采樣點采集完整水柱的藻樣，混合過濾，濃縮后快速轉移至無RNase的凍存管中放入液氮保存。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，構建獲得微囊藻生長率μ和ftsZ基因相對表達量的回歸方程如下：

Y=0.059+0.093X。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，根據回歸方程確定微囊藻的快速生長期的的生長大于0.13 d^-1，得到此時ftsZ基因相對表達量為0.5，該值作為藍藻快速生長期窗口的閾值，再利用該值推斷湖泊原位微囊藻生長率，大于該閾值判定為湖泊藍藻快速生長期。