[發明專利]一種鼻上皮干細胞培養方法及鼻上皮干細胞增殖培養基

有效

• 申請號: 201810400123.2
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108753681B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發明（設計）人: 李春煒;洪玥;何根;謝曦
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 曹愛紅

1.一種鼻上皮干細胞培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)在培養皿中鋪滋養層細胞；

2)從鼻黏膜組織中分離鼻上皮干細胞原代細胞；

3)將鼻上皮干細胞原代細胞鋪在滋養層細胞上，將培養基替換為鼻上皮干細胞增殖培養基，移除其余的組織細胞；

4)當鼻上皮干細胞增殖到80％密度，通過胰酶消化，傳代繼續擴增；

5)將鼻上皮干細胞轉移到氣-液相培養體系和PneumaCult-ALI分化培養基進行分化培養；

所述步驟3)中的鼻上皮干細胞增殖培養基，組分及其終濃度為：DMEM/F12、胎牛血清、青霉素：100x、鏈霉素：100x、胰島素：1-10mg/mL、表皮生長因子：1-20μg/mL、氫化可的松：50-1000μg/mL、3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉：1-20x10^-4M、ROCK抑制劑：0.5-10mM。

2.根據權利要求1所述的鼻上皮干細胞培養方法，其特征在于：步驟1)中，所述滋養層細胞為絲裂霉素處理過的3T3細胞，在12-24小時內可以順利貼壁。

3.根據權利要求2所述的鼻上皮干細胞培養方法，其特征在于：步驟1)中，所述滋養層細胞的培養具體如下：采用DMEM培養基、10％胎牛血清以及1x青霉素-鏈霉素復合液培養3T3細胞；3T3細胞增殖到90％密度，進行絲裂霉素處理，絲裂霉素的處理濃度為0.5-20ug/mL；生長被抑制的滋養層細胞3T3細胞被消化后，按照密度0.1-1x10⁴cells/cm²預先鋪在細胞培養皿中。

4.根據權利要求1所述的鼻上皮干細胞培養方法，其特征在于：

步驟3)中，在滋養層細胞貼壁后，鼻上皮干細胞原代細胞按照密度1-5x10³/cm²鋪在滋養層細胞之上，并且將培養基替換為鼻上皮干細胞培養基，通過換液移除其余的組織細胞；培養條件為37℃，5％CO₂，每隔2-3天換液。

5.根據權利要求1所述的鼻上皮干細胞培養方法，其特征在于：

步驟3)中，還包括在第一代的鼻上皮干細胞增殖培養基中加入霍亂毒素，純化鼻上皮干細胞。

6.根據權利要求5所述的鼻上皮干細胞培養方法，其特征在于：所述霍亂毒素的使用濃度為0.005-0.05μg/mL。

7.根據權利要求1所述的鼻上皮干細胞培養方法，其特征在于：

步驟5)中，將鼻上皮干細胞按照細胞密度1-10x10⁴/cm²轉移到TRANSWELL小室，首先使用鼻上皮干細胞增殖培養基，增殖3-5天，把小室內培養基移除，小室外換用PneumaCult-ALI分化培養基，形成一個氣-液相培養系統。

8.一種鼻上皮干細胞增殖培養基，其特征在于，包括以下組分及終濃度：DMEM/F12、胎牛血清、青霉素：100x、鏈霉素：100x、胰島素：1-10mg/mL、表皮生長因子：1-20μg/mL、氫化可的松：50-1000μg/mL、3,3',5-三碘-L-甲腺原氨酸鈉：1-20x10^-4M、ROCK抑制劑：0.5-10mM。

9.根據權利要求8所述的鼻上皮干細胞增殖培養基，其特征在于：所述鼻上皮干細胞增殖培養基的組分還包括加入霍亂毒素，所述霍亂毒素的使用濃度為0.005-0.05μg/mL。