[發(fā)明專利]一種拮抗重金屬砷生物毒性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810399845.0
• 申請(qǐng)日: 2018-04-28
• 公開（公告）號(hào): CN108486212B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許安;王雪;劉赟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/06
• 分類號(hào): C12Q1/06;G01N33/68;G01N21/31
• 代理公司: 合肥市浩智運(yùn)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 34124
• 代理人: 施興華

1.一種拮抗重金屬砷生物毒性的體外方法，其特征在于：具體步驟如下：

步驟(1)：細(xì)胞的培養(yǎng)：將哺乳動(dòng)物細(xì)胞-野生型人鼠雜交瘤A_L細(xì)胞置于含有5-10％的胎牛血清、1.5×10^-4-2.5×10^-4mol/L的甘氨酸和20-30μg/mL的慶大霉素的Ham’s F12培養(yǎng)基中，在36-37℃，4.5-5.5％CO₂，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20-28小時(shí)；

步驟(2)：納米銀的預(yù)處理：吸掉上述Ham’s F12培養(yǎng)基，并用含有5-10％的胎牛血清、1.5×10^-4-2.5×10^-4mol/L的甘氨酸和20-30μg/mL的慶大霉素的Ham’s F12培養(yǎng)基稀釋納米銀至濃度為0.2-0.3μg/mL，將稀釋后的納米銀加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-15小時(shí)，所述納米銀為聚乙烯吡咯烷酮包被的粒徑為25nm的納米銀；

步驟(3)：納米銀/砷的共處理：用含有5-10％的胎牛血清、1.5×10^-4-2.5×10^-4mol/L的甘氨酸和20-30μg/mL的慶大霉素的Ham’sF12培養(yǎng)基稀釋NaAsO₂水溶液然后加入到步驟(2)的已用納米銀培養(yǎng)的細(xì)胞中，并使砷的終濃度為0-4μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)20-28小時(shí)；

步驟(4)：細(xì)胞毒性檢測：棄去含有納米銀/砷的培養(yǎng)基，然后加入稀釋10-20倍的CCK-8熒光染料100-200μL，置于36-37℃、4.5-5.5％CO₂、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育1-4小時(shí)，采用酶標(biāo)儀測定其在450-490nm處的吸光度；

步驟(5)：蛋白質(zhì)免疫印跡-基因毒性檢測：包括：細(xì)胞內(nèi)總蛋白的提取與濃度測定、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳與轉(zhuǎn)膜、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳與轉(zhuǎn)膜免疫反應(yīng)與顯影；

步驟(6)：基于CD59基因突變技術(shù)的基因毒性檢測：包括：細(xì)胞培養(yǎng)、收集細(xì)胞、固定、染色、流水清洗、計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種拮抗重金屬砷生物毒性的體外方法，其特征在于：步驟(5)的具體檢測步驟為：

①細(xì)胞內(nèi)總蛋白的提取與濃度測定：A_L細(xì)胞經(jīng)上述納米銀/砷處理后，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌2-3次并于800-1000r/min離心2-5分鐘，加入60-120μL含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上靜置25-35分鐘，中間渦旋振蕩2-3次，3-5℃離心并收集上清液于-80～-70℃保存，用蛋白濃度檢測試劑盒測定所提取的蛋白濃度；

②十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳與轉(zhuǎn)膜：將配制好的凝膠安裝于電泳裝置中，注入電泳緩沖液，凝膠加樣孔內(nèi)分別依次加入15μg-30μg同等質(zhì)量已加熱變性的蛋白樣品，開始電泳，起始電壓為60V-100V，待光譜彩虹預(yù)染蛋白條帶分開后，調(diào)整電壓為80V-160V，至預(yù)染蛋白到達(dá)分離膠底部，停止電泳，將分離膠轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)膜容器中進(jìn)行60-90分鐘、250mA-350mA恒流條件下的冰浴轉(zhuǎn)膜；

③十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳與轉(zhuǎn)膜免疫反應(yīng)與顯影：將得到的負(fù)載蛋白條帶的聚偏二氟乙烯膜置于2％-5％的脫脂牛奶中室溫封閉1-2小時(shí)后，按照1：500-1：2000的比例加入一抗，3-5℃孵育過夜，將膜用洗滌緩沖液漂洗3-5次，按照1：5000-1：40000的比例室溫孵育抗鼠二抗1-2小時(shí)后，再次進(jìn)行漂洗，采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)負(fù)載蛋白條帶的膜室溫避光孵育1-5分鐘后使用成像儀進(jìn)行成像，并用Image J軟件進(jìn)行蛋白表達(dá)的定量分析，用β-肌動(dòng)蛋白作內(nèi)參基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種拮抗重金屬砷生物毒性的體外方法，其特征在于：步驟(6)的具體檢測步驟為：

①A_L細(xì)胞經(jīng)納米銀/砷處理后，將其重新種植于細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行6-8天的培養(yǎng)，以使存活細(xì)胞有充足的時(shí)間恢復(fù)至正常生長狀態(tài)且能夠除去突變細(xì)胞后代殘留的CD59抗原；

②收集細(xì)胞，并將5×10⁴個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，于36-37℃、4.5-5.5％CO₂、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2-5小時(shí)后，分別加入抗體和補(bǔ)體，實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置為空白和補(bǔ)體單獨(dú)處理組；

③連續(xù)培養(yǎng)7-10天，直至肉眼可見的克隆形成后，棄去培養(yǎng)液，固定，染色，流水清洗，空氣干燥；

④對(duì)細(xì)胞克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算細(xì)胞突變率。