[發明專利]一種拮抗重金屬砷生物毒性的方法

有效

• 申請號: 201810399845.0
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108486212B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 許安;王雪;劉赟
• 申請（專利權）人: 中國科學院合肥物質科學研究院
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06;G01N33/68;G01N21/31
• 代理公司: 合肥市浩智運專利代理事務所(普通合伙) 34124
• 代理人: 施興華

1.一種拮抗重金屬砷生物毒性的體外方法，其特征在于：具體步驟如下：

步驟(1)：細胞的培養：將哺乳動物細胞-野生型人鼠雜交瘤A_L細胞置于含有5-10％的胎牛血清、1.5×10^-4-2.5×10^-4mol/L的甘氨酸和20-30μg/mL的慶大霉素的Ham’s F12培養基中，在36-37℃，4.5-5.5％CO₂，飽和濕度的細胞培養箱中培養20-28小時；

步驟(2)：納米銀的預處理：吸掉上述Ham’s F12培養基，并用含有5-10％的胎牛血清、1.5×10^-4-2.5×10^-4mol/L的甘氨酸和20-30μg/mL的慶大霉素的Ham’s F12培養基稀釋納米銀至濃度為0.2-0.3μg/mL，將稀釋后的納米銀加入到細胞培養皿中，于細胞培養箱中培養10-15小時，所述納米銀為聚乙烯吡咯烷酮包被的粒徑為25nm的納米銀；

步驟(3)：納米銀/砷的共處理：用含有5-10％的胎牛血清、1.5×10^-4-2.5×10^-4mol/L的甘氨酸和20-30μg/mL的慶大霉素的Ham’sF12培養基稀釋NaAsO₂水溶液然后加入到步驟(2)的已用納米銀培養的細胞中，并使砷的終濃度為0-4μg/mL，繼續培養20-28小時；

步驟(4)：細胞毒性檢測：棄去含有納米銀/砷的培養基，然后加入稀釋10-20倍的CCK-8熒光染料100-200μL，置于36-37℃、4.5-5.5％CO₂、飽和濕度的細胞培養箱中避光孵育1-4小時，采用酶標儀測定其在450-490nm處的吸光度；

步驟(5)：蛋白質免疫印跡-基因毒性檢測：包括：細胞內總蛋白的提取與濃度測定、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳與轉膜、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳與轉膜免疫反應與顯影；

步驟(6)：基于CD59基因突變技術的基因毒性檢測：包括：細胞培養、收集細胞、固定、染色、流水清洗、計數統計。

2.根據權利要求1所述的一種拮抗重金屬砷生物毒性的體外方法，其特征在于：步驟(5)的具體檢測步驟為：

①細胞內總蛋白的提取與濃度測定：A_L細胞經上述納米銀/砷處理后，收集細胞，磷酸鹽緩沖液洗滌2-3次并于800-1000r/min離心2-5分鐘，加入60-120μL含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上靜置25-35分鐘，中間渦旋振蕩2-3次，3-5℃離心并收集上清液于-80～-70℃保存，用蛋白濃度檢測試劑盒測定所提取的蛋白濃度；

②十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳與轉膜：將配制好的凝膠安裝于電泳裝置中，注入電泳緩沖液，凝膠加樣孔內分別依次加入15μg-30μg同等質量已加熱變性的蛋白樣品，開始電泳，起始電壓為60V-100V，待光譜彩虹預染蛋白條帶分開后，調整電壓為80V-160V，至預染蛋白到達分離膠底部，停止電泳，將分離膠轉移至預先加入轉膜緩沖液的轉膜容器中進行60-90分鐘、250mA-350mA恒流條件下的冰浴轉膜；

③十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳與轉膜免疫反應與顯影：將得到的負載蛋白條帶的聚偏二氟乙烯膜置于2％-5％的脫脂牛奶中室溫封閉1-2小時后，按照1：500-1：2000的比例加入一抗，3-5℃孵育過夜，將膜用洗滌緩沖液漂洗3-5次，按照1：5000-1：40000的比例室溫孵育抗鼠二抗1-2小時后，再次進行漂洗，采用超敏ECL化學發光試劑盒對負載蛋白條帶的膜室溫避光孵育1-5分鐘后使用成像儀進行成像，并用Image J軟件進行蛋白表達的定量分析，用β-肌動蛋白作內參基因。

3.根據權利要求1所述的一種拮抗重金屬砷生物毒性的體外方法，其特征在于：步驟(6)的具體檢測步驟為：

①A_L細胞經納米銀/砷處理后，將其重新種植于細胞培養皿中進行6-8天的培養，以使存活細胞有充足的時間恢復至正常生長狀態且能夠除去突變細胞后代殘留的CD59抗原；

②收集細胞，并將5×10⁴個細胞接種于培養皿中，于36-37℃、4.5-5.5％CO₂、飽和濕度的細胞培養箱中孵育2-5小時后，分別加入抗體和補體，實驗對照設置為空白和補體單獨處理組；

③連續培養7-10天，直至肉眼可見的克隆形成后，棄去培養液，固定，染色，流水清洗，空氣干燥；

④對細胞克隆進行計數統計，并計算細胞突變率。