[發明專利]一種建立穩定的次級共生菌人工轉染蚜蟲種群的方法

在審

• 申請號: 201810399784.8
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108782464A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 李遷;陳巨蓮;孫靖軒;范佳;譚曉玲
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;秦夢楠

本發明公開了一種建立穩定的次級共生菌人工轉染蚜蟲種群的方法。本發明利用感染Hamiltonella菌的植物葉片人工轉染不含Hamiltonella菌的蚜蟲種群，通過PCR和原位雜交的方法進行驗證，可以準確獲得與不含Hamiltonella菌的蚜蟲遺傳背景一致的人工轉染的Hamiltonella菌的蚜蟲種群，從而為研究Hamiltonella菌對蚜蟲的影響提供材料基礎。本發明在通過簡單的操作過程即可獲得穩定的人工轉染蚜蟲種群同時排除機械損傷對蚜蟲造成的影響。

技術領域

本發明涉及一種建立穩定的次級共生菌人工轉染蚜蟲種群的方法。

背景技術

麥長管蚜(SitobionavenaeFabricius)屬半翅目Hmioptera，蚜科Aphidinea，長管蚜屬Sitobion，主要分布于亞洲、東非、歐洲、北美等地區，在我國則遍及各產麥區，局部地區危害嚴重。寄主范圍廣泛，主要危害小麥、大麥、燕麥，偶爾為害高粱、玉米和水稻。麥長管蚜主要以取食植物葉片為害為主，產生的蜜露能誘發煤污病，同時是傳播植物病毒的載體，對我國小麥產量和質量造成了重大的影響。

昆蟲與內共生菌的互作關系在自然界普遍存在,幾乎所有昆蟲都含有內共生菌。在長期的協同進化過程中,昆蟲與其體內共生菌形成了密切的互利共生關系，昆蟲為共生菌提供穩定的小生境并共享某些代謝途徑，而內共生菌不僅能為宿主昆蟲提供多種必需營養物質，抵御病原微生物侵染，降低宿主被寄生性天敵寄生的風險，還通過調節宿主耐熱性和抗藥性、改變體色等途徑提高昆蟲對環境的適合度。因此，內共生菌被認為是調控宿主昆蟲新陳代謝及生物學性狀的重要因子之一。

研究表明，昆蟲內共生菌可分為初級共生菌和次級共生菌，初級共生菌主要局限于特化的含菌細胞中，而次級共生菌因其發生概率低很難寄生在宿主昆蟲專一組織中，例如蚜蟲次級共生菌分布于菌胞周圍的鞘細胞和次級菌胞中，或分散或聚集于血腔中。相關研究表明，蚜蟲次級共生菌在提高宿主蚜蟲適應性上具有重要作用。然而這類共生菌很難從蚜蟲體內分離出來。同時，由于不能體外培養，導致對這類共生菌的功能研究只能以蚜蟲為載體，這樣就大大增加了研究難度。面對該瓶頸問題，相關研究人員主要通過顯微注射來達到獲得感染某種次級共生菌的目的，但由于蚜蟲微小、體璧柔軟同時組織液多，因此通過顯微注射導致的機械損傷容易造成高死亡率，同時感染率也具有不穩定性。而且，使用顯微注射的方法操作難度較大，對操作條件包括針頭的粗細程度和注射量的多少也需要不斷摸索，同時獲得轉染蚜蟲種群的時間周期也具有不穩定性。

發明內容

鑒于常規使用顯微注射的方法獲得人工轉染蚜蟲種群的方法存在眾多弊端，而且不能穩定的獲得轉染的蚜蟲種群，這樣會加大對蚜蟲內共生菌功能驗證的難度。針對這一瓶頸問題，本發明提供了一種建立穩定的次級共生菌人工轉染蚜蟲種群的方法。

本發明首先提供了一種感染靶標次級共生菌的蚜蟲種群的構建方法(方法A)，包括如下步驟：

(1)采用含有所述靶標次級共生菌的寄主植物飼喂蚜蟲種群；

(2)完成步驟(1)后，選取單頭蚜蟲構建單性系種群；

(3)完成步驟(2)后，篩選得到感染靶標次級共生菌的蚜蟲種群。

所述步驟(1)中，所述蚜蟲種群為未感染靶標次級共生菌的蚜蟲種群。

所述“未感染靶標次級共生菌的蚜蟲種群”的制備方法(方法B)如下：選取單頭蚜蟲構建單性系種群，篩選得到未感染靶標次級共生菌的蚜蟲種群。

所述“未感染靶標次級共生菌的蚜蟲種群”的鑒定方法包括如下步驟：檢測該種群中任意n頭蚜蟲基因組DNA中是否含有所述次級共生菌的特異片段，如果n頭蚜蟲基因組DNA中均不含有所述次級共生菌的特異片段，則所述蚜蟲種群為未感染靶標次級共生菌的蚜蟲種群。n可為任意自然數，具體可為10。