[發明專利]一種混合微生物發酵過程中微生物定量檢測方法

有效

• 申請號: 201810399300.X
• 申請日: 2018-04-28
• 公開（公告）號: CN108588188B
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 鄭宇;王敏;曹珊;牟俊;楊帥;宋佳;張強
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/06;C12R1/225;C12R1/25;C12R1/02
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明涉及一種食醋固態發酵過程中特定微生物活菌數定量檢測的方法，屬于發酵食品領域。該方法具有結果準確，快速高效，靈敏度高的特點，克服了傳統活菌計數法耗時長，操作強度大，不能計數VBNC細菌等不足，并在現有的PMA?qPCR的基礎上進行條件優化。特別地，開發了一種修復亞致死菌體細胞膜的修復液，適用于細胞膜受損細菌的細胞膜修復，減少菌體亞致死性損傷帶來的假陰性結果，提高了定量結果的準確性，達到了快速準確定量樣品中微生物活菌數的目的。

技術領域：

本發明涉及一種食醋固態發酵過程中特定微生物活菌數定量檢測的方法，屬于發酵食品領域。

技術背景：

食醋、醬油、豆瓣醬、泡菜、黃酒、白酒等傳統食品采用開放式的混合微生物發酵的工藝，其發酵過程中微生物組成復雜，種類多樣。發酵過程中微生物體系的解析尤為重要，特別是乳酸菌和醋酸菌，它們的豐度占細菌群落總豐度的90％以上。瑞士乳桿菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌和巴氏醋酸菌是重要的功能微生物，在傳統食品發酵過程中起主導作用，與發酵過程乳酸、醋酸等有機酸以及乙偶姻、2，3-丁二醇等風味物質代謝密切相關，其活細菌的數目是反映該種菌在生態體系中發揮的實際影響和作用的重要指標。

傳統的細菌培養法是細菌檢測的“金標準”，但其存在操作繁瑣、檢測周期長、易受雜菌干擾，難以檢測“活的非可培養狀態(viable but non-culturable，VBNC)”狀態的細菌的缺點，導致漏檢現象的發生。此外，基于DNA的菌體檢測技術，由于細胞死亡后DNA分子能保留較長時間，難以區分樣品中的“死菌”與“活菌”，易造成假陽性結果。疊氮溴化丙錠(PMA)可被活的微生物完整的細胞膜阻止在外，但能滲入膜損傷細胞并插入雙鏈DNA內。PMA分子中具有光敏性的疊氮基團會分解產生高活性的氮稀類化合物，并與DNA結合位點附近的碳氫化合物反應生成穩定的共價交聯沉淀物，可抑制后續DNA擴增，排除死細菌的干擾準確定量活細菌。固態發酵過程中較高酸度、鹽度、酒精濃度等環境會導致微生物的亞致死性損傷。

通常情況下，致病菌的亞致死損傷轉變是可逆的，受損細胞的修復在生長繁殖之前，在修復過程中，磷脂和核酸可再合成，細胞內物質恢復到正常狀態。受損的細胞有以下特點：(1)修復的過程要先于增殖的過程；(2)在適宜的培養條件下，受損細胞得到修復；(3)處理方式不同，所需的最優溫度和修復時間不同，(4)亞致死損傷的細胞對選擇性成分敏感，完全修復的細胞對選擇性成分有抵抗性。

本技術采用一種可修復菌體損傷細胞膜的修復液孵育細胞，使亞致死性損傷的細胞自我修復，以減少漏檢現象消除計數上的偏差。此外，固態食醋發酵過程中常含有干擾PMA作用的有機物、無機物等，它們不僅能降低染料的濃度，還會干擾PMA與DNA光交聯反應，造成假陽性結果，所以為了更準確地定量菌體，需要優化PMA用量，暗處理與曝光時間等，提高本方法的準確率。

發明內容：

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種傳統食品發酵過程微生物定量檢測的方法，特別地，涉及一種混合微生物固態發酵過程中乳酸菌和醋酸菌活菌定量檢測方法。該方法具有結果準確，快速高效，靈敏度高的特點，克服了傳統活菌計數法耗時長，操作強度大，不能計數VBNC細菌等不足，并在現有的PMA-qPCR的基礎上進行條件優化。特別地，開發了一種修復亞致死菌體細胞膜的修復液，適用于細胞膜受損細菌的細胞膜修復，減少菌體亞致死性損傷帶來的假陰性結果，提高了定量結果的準確性，達到了快速準確定量樣品中微生物活菌數的目的。

本發明解決技術問題所采用的技術方案如下：

一種同時定量檢測混合微生物發酵過程中瑞士乳桿菌、植物乳桿菌、發酵乳桿菌、巴氏醋桿菌活菌數的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)樣品預處理：取待檢樣品1-5g，加入PBS緩沖液(50mmol/L)重懸，紗布過濾去除固體殘渣，取上清，得菌懸液，整個過程均為無菌操作；