[發明專利]固定化腈基水合酶和(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制備方法

有效

• 申請號: 201810393617.2
• 申請日: 2018-04-27
• 公開（公告）號: CN108660131B
• 公開（公告）日: 2020-07-21
• 發明（設計）人: 賈建洪;馮東;葉孫斌;胡成坤;張久明
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N11/10
• 分類號: C12N11/10;C12N11/14;C12N9/88;C12P17/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 陳升華

1.一種固定化腈基水合酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟(1)多糖-碳納米管復合材料的制備：

首先將碳納米管與混酸超聲處理0.5～2小時后，加熱回流10～14小時反應，得到羧基化碳納米管；再將羧基化碳納米管分散于氯化亞砜中，在有機堿的催化下超聲處理0.5～2小時后，加熱回流20～28小時進行氯代反應，得到酰氯化碳納米管；最后酰氯化碳納米管與多糖在有機胺的存在下，于有機溶劑A中超聲處理0.5～2小時后，再在80-100℃下進行酯化反應24-96小時，將多糖修飾于碳納米管上，離心分離得到多糖-碳納米管復合材料；

步驟(2)固定化腈基水合酶的制備：

采用多糖-碳納米管復合材料與腈基水合酶在pH為6.0-7.0的磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液中，10℃～35℃超聲處理0.5～2小時后，再攪拌36～60小時進行固定化，制備固定化腈基水合酶。

2.根據權利要求1所述的固定化腈基水合酶的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的混酸為由體積比2～4：1的濃硫酸和濃硝酸組成，濃硫酸的質量百分數為93％～98.5％，濃硝酸的質量百分數為63％～73％，混酸體積用量以碳納米管的質量計為1-3mL/g。

3.根據權利要求1所述的固定化腈基水合酶的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的有機堿為N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、N,N-二乙基乙酰胺中的一種或兩種以上，有機堿的質量用量為羧基化碳納米管的質量的5％-10％g/g；

所述的氯化亞砜的質量用量為羧基化碳納米管質量的5-10倍g/g。

4.根據權利要求1所述的固定化腈基水合酶的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的多糖為環糊精、殼聚糖、甲基纖維素、乙基纖維素、海藻酸或葡聚糖，多糖的質量用量為羧基化碳納米管質量的3-8倍g/g；

所述的有機胺為三乙胺、二甲氨基吡啶、N,N-二異丙基乙胺、N-甲基嗎啉或者DBU，其質量用量為羧基化碳納米管質量的2-4倍g/g。

5.根據權利要求1所述的固定化腈基水合酶的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的有機溶劑A為N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、2-甲基四氫呋喃、二惡烷中的一種或兩種以上，其體積用量以羧基化碳納米管質量計為30-35mL/g；

所述的離心分離的速率為7000r/min～9000r/min。

6.根據權利要求1所述的固定化腈基水合酶的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液的體積用量以多糖-碳納米管復合材料質量計為20-25mL/g；

所述的多糖-碳納米管復合材料與腈基水合酶重量比為35-55：1。

7.一種(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制備方法，包括以下步驟：

(a)采用權利要求1～6任一項所述的制備方法制備的固定化腈基水合酶；

(b)以固定化腈基水合酶為催化劑，以2-氰基-N-乙基吡咯烷為底物，以pH為6.0-7.0的磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液為反應介質，加入有機溶劑B，在20-40℃下，攪拌反應12-24小時，反應完全后，得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺和(R)-N-乙基吡咯烷-2-羧酸混合液，將混合液分離純化得(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺。

8.根據權利要求7所述的(S)-N-乙基吡咯烷-2-甲酰胺的制備方法，其特征在于，步驟(b)中，所述的固定化氰基水合酶的加入量為2-氰基-N-乙基吡咯烷質量的1％-10％g/g，所述的固定化氰基水合酶的酶活19000-31000U/g；

所述的磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液體積用量以2-氰基-N-乙基吡咯烷質量計為100-150mL/g；

所述的有機溶劑B為N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙醇或異丙醇，其體積用量是磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液體積用量的5％-10％mL/mL。