[發明專利]針對人源ADRB2基因設計的四條sgRNA

有效

• 申請號: 201810382911.3
• 申請日: 2018-04-26
• 公開（公告）號: CN108546703B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 施明;鄭駿年;劉丹;孫毓
• 申請（專利權）人: 徐州醫科大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113
• 代理公司: 北京預立生科知識產權代理有限公司 11736
• 代理人: 李紅偉;高倩倩

本發明屬于基因修飾技術領域，公開了針對人源ADRB2基因設計的四條sgRNA序列。登錄網站檢索人源ADRB2基因的CDS序列，根據sgRNA的設計原則，在其CDS區近5’端采取頭對頭的排列方式，設計了四條sgRNA。在此基礎上，分別構建了單sgRNA表達質粒和多重sgRNA載體。經T7EN1酶切鑒定和TA克隆測序證實兩種質粒轉染HEK293T細胞后均可引導Cas9蛋白切割靶基因，特別是多重sgRNA其基因修飾的效率可高達100％。

技術領域

本發明屬于CRISPR/Cas9基因編輯技術領域，具體是指針對人源ADRB2基因設計的四條sgRNA。

背景技術

基因編輯技術，是近年來發展起來的一項可以對基因進行精準修飾的技術。在科學研究領域，基因編輯技術可用于模式生物的快速構建；在農業領域，該技術可用于植物品種改造；而在健康醫療領域，該技術還有可能通過改造人類自身基因，達到治療疾病的目的。因此，基因編輯技術具有極其廣泛的發展前景和應用價值。

目前，基因編輯技術主要有鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活樣效應因子核酸酶(TALEN)和成簇規律間隔短回文重復技術(CRISPR/Cas9)。技術原理上，三種基因編輯技術都是通過特異序列的靶向識別和切割，造成基因組斷裂，在細胞通過非同源末端連接修復(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重組修復(HR)的過程中達到對基因精確修飾的目的。

鋅指核酸酶作為第一代基因編輯技術，首次實現了對基因的靶向性操作。原理如下：鋅指核糖核酸酶由一個DNA識別域和一個核酸內切酶構成。DNA識別域又是由一系列鋅指蛋白模塊串聯組成，每個鋅指蛋白模塊識別并結合一個特異的三聯體堿基，從而實現核酸內切酶對基因組特定位點的靶向性切割。盡管有文獻報道鋅指核酸酶的基因打靶效率能達到30％，但其發展仍存在較大局限性。一方面，鋅指核酸酶的識別結構域中存在上下文序列依賴性，增加了設計、篩選難度；另一方面，鋅指核酸酶的脫靶切割會導致細胞毒性，制約了其在基因治療領域的應用。

轉錄激活樣效應因子核酸酶(TALEN)是第二代基因編輯技術，TALEN在設計上比ZFN更加簡單，使用上更加靈活。TALEN的作用原理與ZFN相似，但其特異性識別DNA序列的是TALEN蛋白。TALEN蛋白利用其重復單元中第12/13位氨基酸殘基于A、G、C、T形成的保守且恒定的對應關系，進而實現對基因組上任意特定位點的識別、切割。

CRISPR/Cas9是新近發展起來的第三代基因編輯技術，它來源于細菌和古細菌的適應性性免疫系統。前兩代基因編輯技術不同，CRISPR/Cas9系統是RNA介導的Cas9核酸內切酶對特定DNA序列進行識別、切割，進而實現對基因組的精確編輯。其中，起向導作用的RNA被稱為sgRNA(single-guide RNA)。它由兩部分構成，一部分是crRNA(CRISPR RNA)，其通過堿基互補配對原則與靶序列結合，起精準定位的作用，另一部分是tracrRNA(trans-acting CRISPR RNA)，其協助crRNA/Cas9蛋白形成穩定的復合物，實現Cas9在基因組上的精準定位，進而剪切DNA雙鏈，形成DSB(Double Stranded Breaks)缺口，激活細胞自身的DNA損傷修復機制，在修復的過程中造成移碼突變，最終實現靶基因的敲除。

CRISPR/Cas9系統一經出現便在基礎研究領域及研發領域得到廣泛應用，主要是它有著前兩代基因編輯技術無可比擬的優勢。首先，其構建過程簡單，可操作性強，成本低。其次，可以實現單基因多位點或多基因的同時敲除，大大提高了基因編輯的效率。再次，質粒載體體量小，減少了轉染過程中的細胞毒性。最后，可供編輯的位點在基因組上出現頻率高，容易選擇合適的位點進行高效基因編輯操作。除此以外，與目前基因沉默領域應用最為廣泛的基因干擾技術(RNAi)相比，CRISPR/Cas9同樣優勢顯著：

發明內容