[發(fā)明專利]利用特異性分子遺傳標(biāo)記檢測蛇毒種屬來源的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810379375.1
• 申請日: 2018-04-25
• 公開（公告）號: CN110396549B
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 聶麗;杜宏明;陳珊;靳美霞;劉翠秀
• 申請（專利權(quán)）人: 錦州奧鴻藥業(yè)有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 北京市隆安律師事務(wù)所 11323
• 代理人: 劉東方

本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，提供一種利用特異性分子遺傳標(biāo)記檢測蛇毒種屬來源的方法，本發(fā)明方法包括：1)設(shè)計(jì)引物；2)PCR擴(kuò)增及含特異性DNA質(zhì)粒的制備；3)蛇種特異性DNA標(biāo)記物的制備；4)瓊脂糖凝膠電泳分析。本發(fā)明方法具有檢測時(shí)用料少、耗時(shí)短、準(zhǔn)確度高、成本低、操作性強(qiáng)，能夠同時(shí)用于多種不同種屬來源蛇毒的檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，提供一種蛇毒種屬的檢測方法，具體為利用特異性分子遺傳標(biāo)記檢測蛇毒種屬來源的方法。

背景技術(shù)

蛇是四肢退化的爬行動(dòng)物的總稱，屬于爬行綱有鱗目中的蛇亞目。目前全球總共有3,000多種蛇類，其中毒蛇有大約有600多種。我國的蛇類資源豐富，約有200多種，其中毒蛇約為48種，但具有劇毒的蛇類僅有大約10多種。

蛇毒是從毒蛇頭部兩側(cè)眼后下方的毒腺中分泌出來的一種毒液，其經(jīng)排毒導(dǎo)管進(jìn)入毒牙鞘內(nèi)，經(jīng)毒牙擠壓入傷者體內(nèi)，然后隨血液和淋巴擴(kuò)散而引起傷者出現(xiàn)中毒癥狀。蛇毒的成分十分復(fù)雜，主要為蛋白質(zhì)(約占90％～95％)，可分為酶、神經(jīng)毒性多肽、神經(jīng)生長因子、膜活性多肽和其他生物活性肽等5類。

近年來，隨著毒理學(xué)、藥理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)和蛋白組學(xué)的發(fā)展，多種蛇毒的生化組分已經(jīng)得到分離純化，并且在蛇毒的促凝、溶栓、鎮(zhèn)痛、降壓和抗腫瘤等方面進(jìn)行了比較深入的研究。結(jié)果表明蛇毒在醫(yī)藥領(lǐng)域中具有很大的利用價(jià)值，是極為珍貴的藥物原料。

由于不同的毒蛇分泌不同性質(zhì)的蛇毒，即使是同種毒蛇，如果在不同的產(chǎn)地，也可能在蛇毒成分上存在一些差異，所以蛇毒的種屬鑒定，即判定蛇毒來源于哪種毒蛇，無論是在臨床診斷與救治、法醫(yī)工作和蛇毒有效成分生產(chǎn)方面均具有重要意義。蛇毒種類檢測方法包括早期的凝聚測試法、免疫電泳法、放射免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法，到近期的聚合酶鏈反應(yīng)、熒光免疫法、廣譜免疫法等等。其中聚合酶鏈反應(yīng)法(polymerase chain reaction,PCR)是一種體外擴(kuò)大和擴(kuò)增特定DNA片段和RNA片段的技術(shù)。

Suntrarachun等人(Suntrarachun S,Pakmanee N,Tirawatnapong T,et at.De-velopment of a polymerase chain reaction to distinguish monocellate cobra(Naja khouthia)bites from other common Thai snake species,using both venomextracts and bite-site swabs[J].Toxicon,2001,39(7)：1087-1090)首次采用PCR方法鑒定蛇傷，但是鑒于鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性問題，其并沒有將這一技術(shù)完善成可供實(shí)際蛇傷案件適用的方法。該方法在進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)過程中僅參考中國眼鏡蛇的毒素基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，利用所設(shè)計(jì)的引物在其他環(huán)蛇、蝰蛇及眼鏡王蛇中擴(kuò)增，沒有得到片段，進(jìn)而說明利用從蛇咬傷傷口處得到的毒素可以對蛇種進(jìn)行鑒定，引物設(shè)計(jì)不全面，忽略了種間或?qū)匍g及地域差異。

CN201110152346.X公開了一種利用適配子技術(shù)檢測鑒別蛇毒種類的方法，該方法篩選具有高度蛇毒種屬特異性的適配子，并將適配子轉(zhuǎn)為報(bào)告適配子建立蛇毒快速檢測新方法。該方法使用蛇毒范圍較窄，過程復(fù)雜，不易操作，不適合常規(guī)的檢驗(yàn)操作。

PCR擴(kuò)增是以細(xì)胞內(nèi)基因組為模板，而蛇毒屬于動(dòng)物機(jī)體的分泌物，沒有真正意義上的細(xì)胞組織，并且蛇毒價(jià)格昂貴。因此開發(fā)基于DNA聚合酶聯(lián)擴(kuò)增(PCR)的蛇毒種屬來源及純度鑒定方法也是本領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向。

發(fā)明內(nèi)容

針對以上技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明提供這一種利用特異性分子遺傳標(biāo)記檢測蛇毒種屬來源的方法。所述方法包括：

1)設(shè)計(jì)引物:從NCBI核酸數(shù)據(jù)庫選擇蛇的線粒體DNA序列進(jìn)行同源性分析，以種屬特異性的區(qū)域?yàn)楹蜻x靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成引物；