[發(fā)明專利]一種用于早期膀胱癌檢測的試劑盒及其使用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810374359.3
• 申請日: 2018-04-24
• 公開（公告）號(hào): CN108588219B
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邵琦;鐘明
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽達(dá)健醫(yī)學(xué)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于早期膀胱癌檢測的試劑盒及其使用方法。所述試劑盒包括NID2正向引物序列為如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列為SEQ ID NO.2，熒光探針序列為SEQ ID NO.3，探針5′端標(biāo)記FAM，3′端標(biāo)記MGB；此外還包括檢測GAPDH的正向引物及探針，PCR Master Mix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亞硫酸氫鹽溶液和ddH₂O。本發(fā)明所用試劑盒檢測靈敏性、特異性強(qiáng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于早期膀胱癌檢測的試劑盒及其使用方法。

背景技術(shù)

膀胱癌(bladder cancer，BC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，占泌尿系腫瘤的首位，其發(fā)病率和復(fù)發(fā)率呈逐年增加的趨勢。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年約有145 000例患者死于膀胱腫瘤，其中男性發(fā)病率為女性的3～4倍。在來源于上皮組織的膀胱癌中，約90％為移行上皮癌；非上皮性膀胱腫瘤較少見，主要包括未分化癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌，根據(jù)細(xì)胞的分化程度可將其分為3級(jí)。淺表性膀胱癌早期診斷通常有較好的預(yù)后，然而，膀胱癌的復(fù)發(fā)率為60％～70％，居所有實(shí)體瘤的首位，其中11％的復(fù)發(fā)患者會(huì)發(fā)展為浸潤性膀胱癌，患者術(shù)后通常需每年進(jìn)行3～4次膀胱鏡檢查。早期發(fā)現(xiàn)膀胱癌可以增加手術(shù)保留膀胱的機(jī)會(huì)并提高患者總體生存率，因此，如何早期發(fā)現(xiàn)膀胱腫瘤以及術(shù)后如何早期檢測到膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)具有非常重要的臨床意義。

傳統(tǒng)的膀胱癌檢查是膀胱鏡檢查和細(xì)胞學(xué)活檢，但膀胱鏡檢查屬于有創(chuàng)檢查，費(fèi)用高且會(huì)給患者帶來一定痛苦，其結(jié)果可能會(huì)受操作者主觀判斷而帶來一定的誤差；而細(xì)胞學(xué)活檢則存在靈敏度低的缺陷(34％左右)。因此無創(chuàng)檢測，高靈敏高特異性是未來膀胱癌檢測和監(jiān)控手段發(fā)展的方向。

膀胱癌無創(chuàng)檢測的關(guān)鍵在于尋找高靈敏高特異性生物標(biāo)記物，目前這也是膀胱癌研究的一大熱點(diǎn)。中國專利(CN104141009B)公開了一種早期膀胱癌的多靶標(biāo)檢測方法，通過甲基化特異性熒光定量PCR對EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154這七個(gè)標(biāo)志物基因進(jìn)行檢測。其中，NID2的檢測靈敏度僅為23.33％。通過檢測多個(gè)標(biāo)志物基因的甲基化水平，雖然可以有效提高對膀胱癌檢測的靈敏度，但是由于做甲基化特異性熒光定量PCR所用試劑、儀器都較為昂貴，檢測費(fèi)用較高，無疑增加膀胱癌患者的就診負(fù)擔(dān)。因此，尋找靈敏度、特異性高，無需多個(gè)標(biāo)志物同時(shí)檢測，可降低檢測費(fèi)用的檢測膀胱的方法或產(chǎn)品，是眾多膀胱癌患者所亟需的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明主要目的是，提供了一種用于早期膀胱癌檢測的試劑盒及其使用方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明目的之一，提供一種用于早期膀胱癌檢測的引物及探針，所述引物序列如下：NID2的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述熒光探針序列為SEQ ID NO.3，探針5′端標(biāo)記FAM，3′端標(biāo)記MGB。

本發(fā)明目的之二，提供所述引物及探針在制備用于早期膀胱癌檢測的試劑盒的應(yīng)用。

本發(fā)明目的之三，提供一種試劑盒，其包括以上所述的引物及探針；此外還包括檢測GAPDH的引物及探針，PCR Master Mix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亞硫酸氫鹽溶液和ddH₂O。

本發(fā)明目的之四，提供一種上述試劑盒的使用方法，步驟如下：

(1)樣本中基因組DNA的提取：取患者尿沉淀細(xì)胞，利用裂解液，蛋白酶K，漂洗液和ddH₂O提取，得基因組DNA溶液；

(2)DNA甲基化修飾：取步驟(1)提取得到的基因組DNA溶液用亞硫酸氫鹽溶液進(jìn)行修飾，得到甲基化修飾后的DNA；

(3)將步驟(2)修飾后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。