[發明專利]用于構建中棉所50指紋圖譜的SSR引物及其應用

有效

• 申請號: 201810373949.4
• 申請日: 2018-04-24
• 公開（公告）號: CN108570514B
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 劉逢舉;彭軍;劉媛
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發明公開了用于構建中棉所50指紋圖譜的SSR引物及其應用，屬于中棉所50的分子生物學鑒定領域。本發明根據GenBank dbEST數據庫及專業棉花數據庫CMD上釋放獲得的棉花EST序列數據設計并初步篩選獲得268對SSR引物。本發明在上述268對引物中篩選獲得106對具有差異效果的引物。本發明進一步對上述106對引物進行篩選，選出差異較為穩定、多態性好的15對核心引物，加上一對Bt基因特異引物，用于構建中棉所50的特異指紋圖譜。本發明還公開了所述SSR引物在構建中棉所50指紋圖譜以及鑒定中棉所50中的應用。本發明所述SSR引物及所構建的指紋圖譜對中棉所50的品種鑒定與推廣等具有重要價值。

技術領域

本發明涉及用于構建中棉所50指紋圖譜的SSR引物，還涉及所述SSR引物在中棉所50鑒定以及構建中棉所50指紋圖譜中的應用，屬于中棉所50的分子生物學鑒定領域。

背景技術

中棉所50是由中國農科院棉花所早熟課題組育種專家所培育的，2007年通過國家審定，在早熟品種中推廣面積較大。棉花國家區試自2012年始，重新開啟棉花早熟組試驗，中棉所50作為對照品種入選，至今已有5年。但在試驗及推廣過程中，經常發現有數量不等的雜株存在。這一方面干擾了國家早熟區域試驗的正常進行，一方面也可能給廣大棉農帶來經濟上的損失。以往鑒定中棉所50的純度，主要以田間鑒定為主，費時費工。DNA分子標記的出現和快速發展，為中棉所50的準確鑒定提供了一種新的技術手段。簡單重復序列(Simple sequence repeat，SSR)分子標記具有數量豐富、共顯性遺傳、信息含量高、分析方法簡單、結果重現性好等優點，使其成為構建品種分子身份證的較理想的分子標記技術，并且已成功應用于大豆、玉米、小麥、水稻、棉花等作物中。

在被子植物中，卵子和精子核融合形成二倍體的合子，最終發育成胚；受精事件誘發母體的二倍體珠心細胞分化成種皮。因此，棉籽種皮是全部繼承母本遺傳信息的組織，通過分離種皮并從中提取DNA、構建指紋圖譜，能夠獲得母本的指紋；棉籽種仁基本成分則是由卵子和精子核融合形成的二倍體種胚。結合二倍體種胚和母本指紋，就可分析推算該棉花品種是常規種，還是雜交種。早期已有花生、玉米等種皮DNA提取方法的報道(趙久然,劉龍洲,王鳳格等.利用雜交玉米F1代種子果皮組織鑒定母本真實性的SSR研究[J].玉米科學，2004，12(3):6-8；劉龍洲.自玉米F1種子獲得父本、母本全套DNA指紋圖譜的研究[D].新疆農業大學，2004；石運慶,苗華榮,陳高等.花生種皮及籽仁DNA提取方法的研究[J].花生學報，2008,37(4)：37-39.)。棉花的相關報道目前還較少見。為了快速鑒定中棉所50，特采用目前常用的SSR檢測技術，對中棉所50同時進行種皮DNA及種胚DNA的雙重鑒定，構建指紋圖譜，以確保中棉所50的品種純度。但這種方法存在成本偏高、耗時、且一次檢測位點較為有限等不足。因此，開發一種利用專用引物組快速鑒定棉花品種中棉所50的方法，具有重要意義。

發明內容

本發明所要解決的第一個技術問題是提供用于構建中棉所50指紋圖譜的SSR引物；

本發明所要解決的第二個技術問題是提供所述的SSR引物在中棉所50鑒定以及構建中棉所50指紋圖譜中的應用。

為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：

本發明根據GenBank dbEST數據庫及專業棉花數據庫CMD(cotton markerdatabase)上釋放獲得的棉花EST序列數據進行了陸地棉SSR引物的設計，并根據設計引物的穩定性、滲透性、產物的大小以及前后引物的Tm值差異進行了初步篩選，獲得268對引物。本發明利用中棉所6個雜交種的6對親本，對所設計的268對引物的退火溫度及擴增效果進行了初步篩選，結果在268對引物中有248對引物擴增出明確條帶，其中106對為具有差異效果的引物(表現形式主要以條帶長度不一致)，在總引物中占據了40％的比例，證明本發明所述SSR引物具有一定的多態性。