[發明專利]一種采用熒光RT-PCR技術檢測意大利蜜蜂氣味結合蛋白基因OBP6表達的方法有效
| 申請號： | 201810373865.0 | 申請日： | 2018-04-24 |
| 公開（公告）號： | CN108660219B | 公開（公告）日： | 2019-12-17 |
| 發明（設計）人： | 代君君;范濤;舒蕊;劉健;章玉萍;張麗麗;陳明 | 申請（專利權）人： | 安徽省農業科學院蠶桑研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/6888 | 分類號： | C12Q1/6888;C12Q1/686 |
| 代理公司： | 34142 合肥中博知信知識產權代理有限公司 | 代理人： | 錢衛佳 |
| 地址： | 230000 安徽省*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 蜜蜂 氣味結合蛋白 基因 實時熒光PCR 實時熒光 常規PCR 生物技術領域 全封閉反應 相對表達量 熒光RT-PCR 自動化儀器 后處理 電泳 避免污染 表達檢測 繁瑣步驟 技術檢測 肉眼判斷 熒光信號 苯菌靈 靈敏度 主觀性 檢測 總RNA 熒光 引物 掃描 保證 | ||
1.一種采用熒光RT-PCR技術檢測意大利蜜蜂氣味結合蛋白基因OBP6表達的方法，其特征在于，按如下步驟進行：
(1)使用下述引物進行OBP6基因的檢測
符合熒光RT-PCR反應特點的該序列特異上下游引物：如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；
(2)總RNA的提取
采用各種通用的RNA提取方法，從意大利蜜蜂成年工蜂體內提取總RNA；
(3)cDNA合成
以意大利蜜蜂總RNA為模板逆轉錄合成cDNA，反應體系為20μL；
(4)實時熒光RT-PCR
以上述合成的cDNA為模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4為特異性引物，進行實時熒光RT-PCR擴增反應，每個樣品設3個平行管，擴增后所得3個平行管的Ct值取平均數；
(5)意大利蜜蜂在抗生素作用下氣味結合蛋白基因Obp6相對表達量計算，實時熒光RT-PCR后，當目的基因與內參基因的擴增效率相近時，采用2－ΔΔCT法計算抗生素苯菌靈處理前后Obp6基因的相對表達量。
2.根據權利要求1所述采用熒光RT-PCR技術檢測意大利蜜蜂氣味結合蛋白基因OBP6表達的方法，其特征在于，其中每條引物分別配制成濃度為10μmol/L的貯存液，工作濃度為0.4μmol/L。
3.根據權利要求1所述采用熒光RT-PCR技術檢測意大利蜜蜂氣味結合蛋白基因OBP6表達的方法，其特征在于，實時熒光PCR擴增體系設置如下：SYBR Green qPCR Master Mix(2X)：10μl，引物R(10uM)：0.4μl，ddH2O：7.6μl，Template(cDNA)：2μl，Total：20μl。
4.根據權利要求1所述采用熒光RT-PCR技術檢測意大利蜜蜂氣味結合蛋白基因OBP6表達的方法，其特征在于實時熒光PCR擴增參數設置如下：
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