[發(fā)明專利]H7N9禽流感病毒HA蛋白重組桿狀病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810373348.3
• 申請(qǐng)日: 2018-04-24
• 公開（公告）號(hào): CN108384808A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王平;趙文良;蔡明毅;沈琦;任靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海市靜安區(qū)疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號(hào): C12N15/866
• 分類號(hào): C12N15/866;C12N5/10;C07K14/11
• 代理公司: 上海卓陽(yáng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31262
• 代理人: 周春洪

本發(fā)明涉及H7N9禽流感病毒HA蛋白重組桿狀病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)H7N9禽流感病毒血凝素基因，獲得重組HA蛋白，并驗(yàn)證其活性。結(jié)果顯示：PCR結(jié)果顯示重組桿狀病毒表達(dá)載體的擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為4000bp，SDS?PAGE電泳顯示純化的表達(dá)蛋白分子量為63KD，免疫印跡結(jié)果顯示表達(dá)蛋白可以與特異性HA抗體進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)生條帶與理論大小相當(dāng)。血凝試驗(yàn)結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白能使紅細(xì)胞凝集。結(jié)論：禽流感H7N9的HA蛋白在重組桿狀病毒中獲得表達(dá)，并具有血凝活性。本發(fā)明為新型禽流感病毒安全、快速的檢測(cè)提供新思路，也為進(jìn)一步評(píng)估該蛋白用于快速篩選試劑的應(yīng)用價(jià)值提供理論基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是H7N9禽流感病毒HA蛋白重組桿狀病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

H7N9禽流感病毒是一種新型的禽流感病毒，2013年3月底在上海市和安徽省兩地最先被報(bào)道。該病毒是由H7、N9以及H9N2禽流感病毒骨架基因重配而成，病毒傳播到其他地區(qū)之后仍可與當(dāng)?shù)氐腍9N2病毒不斷重配，產(chǎn)生不同的基因型。由于病毒基因突變率高，一旦發(fā)生對(duì)人類呼吸道上皮受體的適應(yīng)性突變，極易導(dǎo)致爆發(fā)性大流行，故公共衛(wèi)生危害較大。H7N9禽流感病毒對(duì)禽類不致病，但人感染后的病死率超過30％，前期研究結(jié)果顯示人類對(duì)其沒有免疫力。因此，建立早期、靈敏、特異診斷H7N9亞型禽流感的方法，對(duì)H7N9患者的診治尤為重要。

研究發(fā)現(xiàn)，盡管不同亞型禽流感病毒的血凝素(hemagglutinin，HA)基因存在較大的差別，但同一亞型的HA基因核苷酸同源性較高，編碼的蛋白質(zhì)同源性也很高，因此可以作為診斷抗原。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(baculovirus expression system，BES)，是以桿狀病毒為表達(dá)載體的真核表達(dá)系統(tǒng)，以其安全、高效、穩(wěn)定的特性在病原體診斷試劑的制備中得到廣泛應(yīng)用。本發(fā)明利用桿狀病毒表達(dá)了H7N9禽流感病毒HA基因并驗(yàn)證其活性，為后期H7N9禽流感病毒快速診斷試劑盒的研制提供數(shù)據(jù)支持。

中國(guó)專利200510017149.1公開一種能有效檢測(cè)致病致死率極高的禽流感H5亞型的HA抗體的H5亞型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白，首先將pUCM-TH5HA質(zhì)粒由BamH I、EcoRV雙酶切，得到的pPIC9K質(zhì)粒由EcoR I線性化，再經(jīng)T4連接酶連接獲得質(zhì)粒pPIC9K-H5HA；用SalI線性化pPIC9K-H5HA重組質(zhì)粒，經(jīng)過一系列工作后即得到H5HA抗原蛋白，具有表達(dá)量高、特異性強(qiáng)、易于純化、具有完整的空間構(gòu)象等特點(diǎn)完全符合ELISA快速檢測(cè)試劑盒的鑒定要求。中國(guó)專利200510068057.6公開了一種新的編碼禽流感血凝素蛋白的基因NAIVHA以及該基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和表達(dá)；該基因能夠在植物中高效表達(dá)，與野生型禽流感血凝素基因相比，其表達(dá)量提高了約近40倍。現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于本發(fā)明H7N9禽流感病毒HA蛋白重組桿狀病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，目前還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種H7N9禽流感病毒HA蛋白重組桿狀病毒表達(dá)載體。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種宿主細(xì)胞。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供如上所述的桿狀病毒表達(dá)載體的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

H7N9禽流感病毒HA蛋白重組桿狀病毒表達(dá)載體，所述桿狀病毒表達(dá)載體通過如下方法構(gòu)建：

合成H7N9禽流感病毒全長(zhǎng)HA基因，利用以下特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

5’-AAATATGCGGCCGCATGAACACTCAAATCCTGGTATTCG-3’作為上游引物；

5’-ACATGCATGCTTAGTGATGATGGTGGTGATGTATACAAATAGTGCACCG-3’作為下游引物；