[發明專利]用于構建陸地棉品種指紋圖譜的SSR引物及其應用

有效

• 申請號: 201810373199.0
• 申請日: 2018-04-24
• 公開（公告）號: CN108570513B
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 劉逢舉;彭軍;劉媛
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發明公開了用于構建陸地棉品種指紋圖譜的SSR引物及其應用，屬于陸地棉品種的分子生物學鑒定領域。本發明根據GenBank dbEST數據庫及專業棉花數據庫CMD上釋放獲得的棉花EST序列數據設計并初步篩選獲得268對SSR引物。本發明利用中棉所6個雜交種的6對親本對所設計引物的擴增效果進行篩選，結果其中有106對引物具有差異效果。本發明進一步對上述106對引物進行篩選，選出差異較為穩定、多態性好的15對核心引物，加上一對Bt基因特異引物，用于構建棉花品種的特異指紋圖譜或構建國審陸地棉品種分子身份證。本發明還公開了所述的SSR引物在構建陸地棉品種分子身份證或者構建陸地棉品種指紋圖譜中的應用。

技術領域

本發明涉及用于構建陸地棉棉花品種指紋圖譜的SSR引物，還涉及所述SSR引物在建立陸地棉花棉品種分子身份證或指紋圖譜中的應用，屬于陸地棉品種的分子生物學鑒定領域。

背景技術

目前，每年申請參加黃河、長江及西北內陸三大流域國家審定的陸地棉新品種(系)多達上百個。很多新品種特別是同一地方選育出來的新品種(系)，大多利用少數優良常規品種作為親本，品種的遺傳基礎相對狹窄；因此，利用形態特征、生理特性等來鑒定品種的純度和真偽較為困難。基于此，近年來，棉種市場上F2代冒充F1代雜種，或者在F1代雜種中摻有大量親本種子的事實不斷出現，使棉農蒙受損失。如何鑒別棉種的真偽、品種純度成為一個亟待解決的問題。

DNA分子標記的出現和快速發展，為棉花品種的準確鑒定提供了一種新的技術手段。簡單重復序列(Simple sequence repeat，SSR)分子標記具有數量豐富、共顯性遺傳、信息含量高、分析方法簡單、結果重現性好等優點，使其成為構建品種分子身份證的較理想的分子標記技術，并且已成功應用于大豆、玉米、小麥、水稻、棉花等作物中。以此方法構建品種的分子指紋圖譜、鑒別品種的真偽和純度，對種子產業化和品種的知識產權保護有重大意義。但這種方法存在成本偏高、耗時、且一次檢測位點較為有限等不足。因此，開發一種快速構建國家審定的陸地棉品種分子身份證或指紋圖譜的方法，具有重要意義。

發明內容

本發明所要解決的第一個技術問題是提供用于構建陸地棉品種指紋圖譜的SSR引物；

本發明所要解決的第二個技術問題是提供所述的SSR引物在構建陸地棉品種分子身份證或者指紋圖譜中的應用。

為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：

本發明根據GenBank dbEST數據庫及專業棉花數據庫CMD(cotton markerdatabase)上釋放獲得的棉花EST序列數據進行SSR引物的設計，并根據設計引物的穩定性、滲透性、產物的大小以及前后引物的Tm值差異進行了初步篩選，獲得268對引物。本發明利用中棉所6個雜交種的6對親本，對所設計的268對引物的退火溫度及擴增效果進行了初步篩選，結果在268對引物中有248對引物擴增出明確條帶，其中106對為具有差異效果的引物(表現形式主要以條帶長度不一致)，在總引物中占據了40％的比例，證明本發明所述SSR引物具有一定的多態性。

本發明進一步通過對中棉所6個雜交種樣本進行SSR擴增反應，對上述106對引物在12個親本品種中具有差異效果的特異SSR標記進行篩選。最終，本發明從上述106對具有疑似差異擴增效果的引物中，選擇出差異較為穩定、多態性好的15對核心引物，加上一對Bt基因特異引物，用于構建棉花品種的特異指紋圖譜或國審陸地棉品種分子身份證。

本發明所述的15對核心SSR引物及一對Bt基因特異引物，包括：由核苷酸序列為SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列為SEQ ID No.2所示的下游引物組成的引物對1(即引物M003)；

由核苷酸序列為SEQ ID No.3所示的上游引物和核苷酸序列為SEQ ID No.4所示的下游引物組成的引物對2(即引物M006)；