[發明專利]熒光顯微鏡系統的對焦方法及裝置

有效

• 申請號: 201810371435.5
• 申請日: 2018-04-24
• 公開（公告）號: CN108398775B
• 公開（公告）日: 2019-11-22
• 發明（設計）人: 戴瓊海;謝浩;孔令杰;范靜濤
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: G02B21/24
• 分類號: G02B21/24
• 代理公司: 11201 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 張潤<國際申請>=<國際公布>=<進入國

本發明公開了一種熒光顯微鏡系統的對焦方法及裝置，其中，方法包括以下步驟：對焦區域選取步驟：在軸向掃描熒光樣本過程中選取多個清晰對焦的特征區域，并記錄每個特征區域的清晰圖像和位置；角度?軸向位置迭代調節優化步驟：根據每對焦區域的中心坐標獲取角度和軸向位置的移動量，以移動后進行圖像匹配對準，并測量每對焦區域的中心坐標后再次迭代優化，以實現對焦。該方法適用于樣本在調節過程中發生變化的情況，適用于寬視場熒光成像，有效提高了對焦速度和穩定性。

技術領域

本發明涉及顯微鏡系統對焦技術領域，特別涉及一種熒光顯微鏡系統的對焦方法及裝置。

背景技術

熒光顯微成像在生物醫學研究領域有著重要應用，尤其是在臨床診斷等領域日益受到人們的廣泛重視。熒光顯微技術常采用平面探測器對樣本成像，只有物鏡焦面上的能夠在探測器上清晰成像。因此需要發展調焦技術使樣本的目標平面和顯微鏡焦面重合。

當前的自動顯微對焦技術大致可分為主動對焦技術和被動對焦技術。前者主動發出紅外或者超聲探測目標物體的位置，機械調節物距或者像距實現對焦。后者基于探測到圖像的清晰度等參數調節顯微鏡的物距或者像距實現軸向(如專利CN-1065341A中公開的一種光學圖像系統的調焦方法及裝置)和角度(如專利CN1296742C中公開的一種光學成像系統的角度自動調焦系統及方法)的自動對焦。

主動式自動對焦方法無法直接用于熒光顯微：由于熒光的特性，紅外或者超聲探測到的表面無法保證和所需要對焦的熒光目標平面重合。現有的被動式自動對焦方法應用于熒光顯微鏡有三點重要缺陷：1.圖像的清晰度函數依賴于探測樣本的單峰性質，即目標函數僅在目標平面上達到最大值。這點在具有三維結構的熒光顯微樣本中往往難以滿足。2.現有的探測技術大多采用步進法探測尋找圖像最清晰位置。兩個角度調節加上軸向位移調節總共三個自由度的步進調節不僅對焦時間較長，而且光照引起樣本熒光染料光漂白等效應直接影響對焦結果3.未考慮樣本角度變化對樣本的狀態產生的變化。熒光顯微鏡的觀察樣本往往處在復雜的固體液體環境中，姿態改變過程中會因為重力等因素的影響而改變探測光路。綜上，現有的自動顯微對焦技術運用于熒光顯微鏡中具有缺陷。

發明內容

本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。

為此，本發明的一個目的在于提出一種熒光顯微鏡系統的對焦方法，該方法適用于寬視場熒光成像，有效提高了對焦速度和穩定性。

本發明的另一個目的在于提出一種熒光顯微鏡系統的對焦裝置。

為達到上述目的，本發明一方面實施例提出了一種熒光顯微鏡系統的對焦方法，包括以下步驟：對焦區域選取步驟：在軸向掃描熒光樣本過程中選取多個清晰對焦的特征區域，并記錄每個特征區域的清晰圖像和位置；角度-軸向位置迭代調節優化步驟：根據每對焦區域的中心坐標獲取角度和軸向位置的移動量，以移動后進行圖像匹配對準，并測量所述每對焦區域的中心坐標后再次迭代優化，以實現對焦。

本發明實施例的熒光顯微鏡系統的對焦方法，采用圖像匹配相關函數進行調焦，克服了傳統清晰度函數無法直接用于熒光圖像的問題，采用軸向-角度交替優化算法進行調焦，加快收斂速度，采用迭代算法調焦，適用于樣本在調節過程中發生變化的情況，適用于寬視場熒光成像，有效提高了對焦速度和穩定性。

另外，根據本發明上述實施例的熒光顯微鏡系統的對焦方法還可以具有以下附加的技術特征：

進一步地，在本發明的一個實施例中，還包括：圖像匹配對準步驟：利用記錄的所述清晰圖像對移動后采集的樣本圖像進行匹配，并更新各個子區域的中心坐標。