[發(fā)明專利]一種基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)血漿中羧酸類代謝物的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810368036.3
• 申請(qǐng)日: 2018-04-23
• 公開（公告）號(hào): CN108931603A
• 公開（公告）日: 2018-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡清源;何昀潞;侯宏衛(wèi);羅彥波;陳歡;陳建
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心
• 主分類號(hào): G01N30/88
• 分類號(hào): G01N30/88;G01N30/86
• 代理公司: 北京瑞恒信達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11382
• 代理人: 侯淑紅;孫維傲

本發(fā)明涉及一種基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)血漿中羧酸類代謝物的方法，本方法通過對(duì)差異標(biāo)記的血漿樣品的信號(hào)識(shí)別，改善了質(zhì)譜檢測(cè)羧酸類代謝物時(shí)離子化效率低和靈敏度不足的問題，實(shí)現(xiàn)了樣品中含羧基化合物的非靶向分析，還可用于穩(wěn)定的相對(duì)定量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)血漿中羧酸類代謝物的方法。

背景技術(shù)

羧酸類代謝物構(gòu)成了大量生物學(xué)上有意義的分子，包括小分子有機(jī)酸、脂肪酸、氨基酸、小分子肽等，已被證明以痕量水平參與了能量代謝、腸道菌代謝、胰島素分泌和炎癥反應(yīng)等生理病理學(xué)過程，在調(diào)控各種生理功能中起著重要作用。因此，開發(fā)對(duì)羧酸類代謝物高靈敏度和高準(zhǔn)確性的檢測(cè)方法在生化研究和疾病診斷方面具有重要的意義。

目前對(duì)血漿中羧酸類代謝物的分離分析方法大多數(shù)是靶向的，即在有標(biāo)準(zhǔn)品的前提下對(duì)部分已知的感興趣的羧酸類代謝物或某個(gè)代謝通路上的羧酸類代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量分析。但獲得全面性的代謝通路和總代謝物信息，在某種程度上被認(rèn)為比單一代謝物實(shí)現(xiàn)非常低的檢測(cè)限更重要。然而，目前針對(duì)血漿中羧酸類代謝物的全分析方法研究還較少。

質(zhì)譜是一種高靈敏度和特異性的檢測(cè)方法。羧酸類化合物通常在質(zhì)譜負(fù)離子模式下檢測(cè)，但檢測(cè)靈敏度通常較低；由于羧基的低氣相質(zhì)子親和力，羧酸類代謝物在正離子模式下常表現(xiàn)出較低的響應(yīng)，同時(shí)用于分離羧酸的流動(dòng)相(酸化以促進(jìn)反相色譜的保留)不總與電噴霧電離-質(zhì)譜相容；由于羧基間氫鍵的相互作用，羧酸類代謝物具有相對(duì)低的蒸氣壓，無法直接進(jìn)入氣相色譜-電子轟擊-質(zhì)譜中分析。此外，即使在相同的色譜條件下，質(zhì)譜的信號(hào)響應(yīng)容易波動(dòng)，離子化效率易發(fā)生變化。因此，常在質(zhì)譜分析前向樣本中加入內(nèi)標(biāo)以矯正質(zhì)譜信號(hào)的變化，但該方法仍有一些限制：代謝物可能不與內(nèi)標(biāo)共洗脫，引起定量的不準(zhǔn)確；生物樣本中的代謝物在結(jié)構(gòu)和含量上的差異，使得內(nèi)標(biāo)的加入量難以確定；難以獲取所有內(nèi)標(biāo)物等。因此，開發(fā)一種靈敏度高、定量準(zhǔn)確且能對(duì)血漿中羧酸類代謝物進(jìn)行全分析的方法顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)血漿中羧酸類代謝物的方法，本方法通過對(duì)差異標(biāo)記的血漿樣品的信號(hào)識(shí)別，改善了質(zhì)譜檢測(cè)羧酸類代謝物時(shí)離子化效率低和靈敏度不足的問題，實(shí)現(xiàn)了樣品中含羧基化合物的非靶向分析，還可用于穩(wěn)定的相對(duì)定量。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

首先，本發(fā)明提供一種基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)血漿中羧酸類代謝物的方法，所述方法包含以下步驟：

(1)血漿樣品溶液的制備：血漿中加入提取溶液進(jìn)行提取，渦旋混勻后離心取上層有機(jī)相，于氮?dú)庀麓蹈桑瑥?fù)溶于乙腈中作為樣品溶液備用；

(2)樣品溶液的同位素標(biāo)記：取步驟(1)中的樣品溶液與催化劑和激活劑充分混勻后，加入“輕”同位素衍生化試劑進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完成后，反應(yīng)體系置于-20℃條件下冷凍10min即終止反應(yīng)，用緩慢氮?dú)饬鞔蹈桑霉腆w樣品復(fù)溶于乙腈/水(50/50，v/v)中，即得到“輕”同位素標(biāo)記的衍生化產(chǎn)物；將“輕”同位素衍生化試劑換為“重”同位素衍生化試劑重復(fù)上述操作，得到“重”同位素標(biāo)記的衍生化產(chǎn)物；將“輕”“重”衍生化產(chǎn)物等比例混合均勻，即得待測(cè)液；

(3)羧酸類代謝物的非靶向代謝組學(xué)分析：取步驟(2)中的待測(cè)液進(jìn)行液相色譜-雙中性丟失掃描-質(zhì)譜檢測(cè)，基于“輕”“重”衍生化產(chǎn)物的質(zhì)荷比差異，掃描選定的中性丟失片段，結(jié)合保留時(shí)間與質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行篩選，找出潛在的羧酸類代謝物。

優(yōu)選地，所述提取溶液包含提取劑和/或0.5％的甲酸；

優(yōu)選地，所述提取劑選自乙酸乙酯、乙腈、甲苯、氯仿和正己烷中的一種或多種，優(yōu)選為乙酸乙酯；

優(yōu)選地，所述提取劑與0.5％的甲酸的體積比為30：1；